試劑：氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC處理過的水配制）。

操作步驟：勻漿處理

a、植物組織

以葉片RNA提取為例.取新鮮葉片在液氮中充分研磨或將葉片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超過1min.，大約100mg 葉片使用1 ml Trizol。

b、動物組織

以鼠肝臟RNA提取為例.取新鮮或-70℃凍存組織,每50-100mg組織加1ml Trizol,用勻漿儀進行勻漿處理.樣品體積一般不要超過Trizol體積的10%。

c、單層培養(yǎng)細胞

直接在培養(yǎng)板中加入Trizol裂解細胞,每10cm2面積加1ml Trizol.用取樣器吹打幾次.

注意:Trizol加量根據培養(yǎng)板面積決定,不是由細胞數決定.如果Trizol加量不足,可能導致提取的RNA中有DNA污染。

d、細胞懸液

離心取細胞，每5-10×106動物、植物和酵母細胞或每107細菌細胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗滌細胞，以免降解mRNA。一些酵母和細菌細胞可能需要勻漿儀處理。

e、血液處理

1.直接取新鮮的血液,加入3倍體積紅細胞裂解液，混勻后室溫放置10min，10 000rpm 離心1min。棄上清，收集白細胞沉淀。每1ml血液收集的白細胞沉淀中加入1ml Trizol。

2. 將勻漿樣品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白復合物完全分離。

3. 可選步驟:4 ℃ 10 000rpm離心10min，取上清。

如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結節(jié)部分等，可離心去除。離心得到的沉淀中包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織樣品時，上層是大量油脂，應除去。取澄清的勻漿溶液進行下一步操作。

4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15s，室溫放置3min。如不能渦旋混勻，可手動顛倒混勻2min代替。

5. 4 ℃ 10 000rpm離心10-15min，樣品會分成三層：紅色的有機相，中間層和上層無色的水相，RNA主要在水相中，把水相（約600ul，約為所用Trizol試劑的60%）轉移到新管中。（如要分離蛋白質和DNA，可保留黃色的有機相）

6. 在得到的水相溶液中加入等體積的異丙醇，混勻，-20℃ 放置20-30min。

植物或動物組織RNA提取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，導致電泳檢測時看不到RNA?？梢园匆韵虏襟E操作減輕污染：在上清中加入1/2體積的異丙醇，1/2體積的RNA助沉劑，然后進行以下操作。

7. 4 ℃ 10 000rpm離心10min，去上清。

離心前RNA沉淀經常是看不見的，離心后在管側和管底形成膠狀沉淀。

8. 加入1ml 75%乙醇（DEPC水處理過的水配制）洗滌沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。

9. 4 ℃ 10 000rpm離心2min，棄上清；短暫快速離心，用移液器小心吸棄上清，注意不要吸棄沉淀。

10. 室溫放置晾干（不要晾得過干，RNA完全干燥后會很難溶解，大約晾干2-3min左右即可）。加入適量DEPC水（根據實驗需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用槍頭吸打幾次，充分溶解RNA。如RNA用于酶切反應，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。

注意事項

1. 從少量樣品中提取RNA(1-10mg組織或102-104細胞) ：

加800ul Trizol，樣品裂解后加氯仿，分層，沉淀RNA前，加5-10ug RNase-free糖原，糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml時不會影響反轉錄cDNA第一鏈的合成，也不影響PCR反應。

2. 勻漿后，加氯仿前，樣品可在-70 ℃放置一個月以上：

RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8 ℃一個星期或-20 ℃一年以上。如果要長期保存，RNA可以溶解于100%去離子甲酰胺中，-70 ℃長期保存。

預防RNase污染，應注意以下幾個方面

1. 經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌，可能導致RNase污染。

2. 使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

3. RNA在Trizol試劑中不會被RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

4. 配制溶液應使用無RNase的水（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至中濃度0.1%(v/v)，放置過夜，高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。

不同組織或細胞RNA提取預期得率

植物葉片 100-200ug/g葉片

動物組織 200-400ug/g肝臟組織

動植物培養(yǎng)細胞 5-10ug/106細胞

大腸桿菌 2-10ug/mlDH5α過夜菌

血液 3-5ug/ml人全血