非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是一種肺癌患者占比最高的癌癥，死亡率極高。長(zhǎng)散在重復(fù)序列1（L1）屬于一系列非長(zhǎng)末端重復(fù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，被證明與肺癌存在密切聯(lián)系，而現(xiàn)有研究方法難以研究L1在改變腫瘤細(xì)胞代謝中的作用。近日，天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院于津浦課題組聯(lián)合西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院在《Molecular Cancer》（IF:41.4）上發(fā)表了非小細(xì)胞肺癌最新研究成果《LINE-1 promotes tumorigenicity and exacerbates tumor progression via stimulating metabolism reprogramming in non-small cell lung cancer》，使用ReFuse（逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因融合估計(jì)程序）這一新型生物信息學(xué)方法，揭示了L1通過(guò)L1-FGGY嵌合轉(zhuǎn)錄本激活花生四烯酸代謝途徑導(dǎo)致代謝重編程，從而刺激Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和其他致癌信號(hào)通路，加速肺癌發(fā)展。在本實(shí)驗(yàn)中，為了驗(yàn)證GPR31對(duì)細(xì)胞功能的影響，及其與泛素特異性蛋白酶USP24結(jié)合的可能性，作者使用漢恒生物提供的慢病毒進(jìn)行了GPR31和USP24的敲低。

首先作者利用TCGA的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定并量化了L1基因鑲和轉(zhuǎn)錄本（LCTs），并發(fā)現(xiàn)肺腺癌（LUAD）和肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）腫瘤樣本中的LCT事件和表達(dá)顯著增加。大多數(shù)LCT發(fā)生在剪接連接位點(diǎn)，暗示通過(guò)內(nèi)膜L1啟動(dòng)子激活進(jìn)行轉(zhuǎn)剪可能是LCT形成的主要原因。

圖1. 通過(guò)ReFuse識(shí)別LCT事件

對(duì)分析TCGA腫瘤樣本RNASeq結(jié)果表明，L1活性與代謝過(guò)程、腫瘤基因組突變程度和腫瘤分期呈正相關(guān)，而與免疫反應(yīng)、甲基化水平呈負(fù)相關(guān)。將肺小細(xì)胞癌患者組織的樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序分析后，作者發(fā)現(xiàn)ReFuse從組織或單細(xì)胞RNAseq數(shù)據(jù)中檢測(cè)到的LCT事件具有高度一致性，腫瘤細(xì)胞和上皮細(xì)胞中LCT事件更高，這些細(xì)胞中線粒體功能增加，核糖體生物發(fā)生和代謝途徑活化。

圖2. LCT與代謝、免疫過(guò)程和基因組不穩(wěn)定性相關(guān)

圖3. 非小細(xì)胞肺癌中單細(xì)胞水平的LCT活性變化

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隨后，作者選取具有差異表達(dá)和高頻重復(fù)讀取率的L1-FGGY進(jìn)一步探索其潛在的致癌作用，對(duì)相關(guān)性較大的花生四烯酸（AA）代謝下游進(jìn)行的表達(dá)分析顯示，12-LOX和15-LOX表達(dá)明顯上調(diào)，提示L1-FGGY通過(guò)AA代謝激活LOX途徑。在NCI-H520中過(guò)表達(dá)L1-FGGY，發(fā)現(xiàn)AA代謝途徑的富集，和12S-HETE（12-LOX下游代謝物）蛋白水平的升高。

圖4. L1-FGGY啟動(dòng)花生四烯酸（AA）代謝重編程并激活12-LOX途徑

接下來(lái)，作者進(jìn)一步探索了147個(gè)LUSC腫瘤樣本中參與LOX代謝途徑的三種中心酶，觀察到L1-FGGY+組織中12-LOX和15-LOX的表達(dá)增加，而僅12-LOX與患者生存率相關(guān)?；颊呓M織中12-LOX和12S-HETE（12-LOX代謝產(chǎn)物）膜受體蛋白GPR31顯著上調(diào)。在H520細(xì)胞中進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)也證明L1-FGGY對(duì)12-LOX及12S-HETE的正調(diào)控，并通過(guò)12-LOX通路促進(jìn)H520細(xì)胞增殖和侵襲。

圖5 L1-FGGY表現(xiàn)出致癌作用，依賴于12-LOX / GPR31代謝途徑的激活。

為了探索參與L1-FGGY驅(qū)動(dòng)癌癥的信號(hào)通路，作者觀察到Wnt信號(hào)相關(guān)基因——如Wnt3a、Wnt5a、p-GSK、p-JNK——在L1-GFFY+組織或過(guò)表達(dá)細(xì)胞中均顯著上調(diào)，而這種過(guò)表達(dá)在12-LOX或GPR31被抑制時(shí)得到恢復(fù)。然而L1-FGGY過(guò)表達(dá)后GPR31的RNA水平無(wú)顯著變化，蛋白表達(dá)卻顯著增加，作者提出泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解被L1-FGGY改變這一假設(shè)，并通過(guò)STRING分析發(fā)現(xiàn)泛素相關(guān)蛋白USP24。作者證實(shí)GPR31的泛素水平與L1?FGGY呈負(fù)相關(guān)，這種影響被USP24敲低抑制，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示USP24與FGGY或GPR31結(jié)合。最后，作者發(fā)現(xiàn)L1-FGGY降低了USP24的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合蛋白FGGY的表達(dá)，從而促進(jìn)了USP24與GPR31的結(jié)合。

圖6 L1-FGGY通過(guò)促進(jìn)GPR31泛素化和增強(qiáng)12S-HETE/GPR31相互作用激活Wnt信號(hào)

為了探究L1-FGGY對(duì)體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的影響，作者進(jìn)行了裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)L1-FGGY顯著促進(jìn)了腫瘤的增長(zhǎng)，而逆轉(zhuǎn)錄酶和12-LOX表達(dá)的降低抑制了腫瘤生長(zhǎng)。L1-FGGY的過(guò)表達(dá)在mRNA或蛋白水平上顯著促進(jìn)了12-LOX、Wnt相關(guān)蛋白、GRP31的表達(dá)，而抑制了FGGY表達(dá)；免疫細(xì)胞群的觀察結(jié)果也顯示L1-FGGY抑制CD3+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞群和CD86+ DC細(xì)胞浸潤(rùn)，而抑制逆轉(zhuǎn)錄酶和12-LOX表達(dá)則會(huì)緩解甚至逆轉(zhuǎn)這些變化。

圖7 逆轉(zhuǎn)錄酶或12-LOX抑制劑抑制LUSC異種移植物生長(zhǎng)，逆轉(zhuǎn)體內(nèi)免疫抑制微環(huán)境

總的來(lái)說(shuō)，作者開(kāi)發(fā)了一種基于局部比對(duì)的生物信息學(xué)工具，用于檢測(cè)組織和單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)中對(duì)肺癌具有高敏感性的全基因組LCT，并發(fā)現(xiàn)了高度表達(dá)的L1-FGGY，揭示了L1-FGGY在肺癌致瘤性代謝編程中的功能作用——刺激AA途徑和脂肪酸代謝的途徑，從而影響Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和其他致癌信號(hào)通路，并影響體內(nèi)腫瘤微環(huán)境。這一發(fā)現(xiàn)暗示了L1作為癌癥診斷和預(yù)后的候選標(biāo)志物，并為存在LCT的患者提供更有效的潛在癌癥治療策略。