注：本文不構(gòu)成任何投資意見和建議，以官方/公司公告為準；本文僅作醫(yī)療健康相關(guān)藥物介紹，非治療方案推薦（若涉及），不代表平臺立場。任何文章轉(zhuǎn)載需得到授權(quán)。

“穩(wěn)定”一詞的定義是用來形容事物穩(wěn)固安定，沒有變動。藥品“安全、有效、質(zhì)量可控”的三要素投射到“穩(wěn)定”的研究和考察上，被賦予了成為制藥術(shù)語特色化的意義延伸。在整個大分子藥物開發(fā)流程中，不止一次涉及“穩(wěn)定性”相關(guān)研究內(nèi)容。在CMC開發(fā)的起點——細胞株構(gòu)建過程中，穩(wěn)定性研究也作為一項重點內(nèi)容，在單克隆評價中起了至關(guān)重要的作用。

細胞株構(gòu)建階段的穩(wěn)定性研究指細胞株遺傳穩(wěn)定性研究，旨在前期研發(fā)篩選階段通過模擬后期大規(guī)模生產(chǎn)代次、工藝或條件對候選單克隆細胞株進行評估，以探究并保證細胞株的可放大性及表達抗體質(zhì)量。

CHO作為生物制藥行業(yè)經(jīng)典的哺乳動物蛋白表達系統(tǒng)，其來源及歷史沿革已有眾多文章進行了詳盡的梳理和總結(jié)，在此不再贅述。作為染色體少于常見實驗動物（最初報道CHO有22條染色體）的良好研究模型，相應(yīng)CHO細胞的異質(zhì)性也在業(yè)內(nèi)具備普遍共識。有研究表明，在上世紀70年代，CHO細胞的某些亞克隆染色體已減少為21條甚至20條。除了染色體數(shù)目的變化，另有研究揭示，CHO細胞染色體也會自行發(fā)生交換及重排等現(xiàn)象。對于CHO細胞3號染色體上編碼APRT、LDHA及GAA酶的基因進行考察，相對編碼酶基因的位置在染色體上發(fā)生了倒置重排，形成了新的Z4染色體，如下圖A所示；相鄰的3號及4號染色體間也發(fā)現(xiàn)了基因重組交換現(xiàn)象，形成了新的Z3及Z7染色體。

FIGURE 1 Generation of three Z-chromosomes by rearrangements.

由此，有著名學(xué)者認為，由于CHO細胞具有非常強的異質(zhì)性，可以認為其基因在不斷傳代中時刻處于動態(tài)變化的過程，因此沒有真正意義上的“均一”的CHO細胞庫。而CHO細胞的這一特性顯然會給制藥工藝過程及表達產(chǎn)物帶來不確定性，與“可控”的目的背道而馳。因此，從質(zhì)量控制的角度而言，細胞株的穩(wěn)定性考察顯得尤為重要，實際工作中，我們需要通過充分的研究，考察細胞株在生產(chǎn)窗口及工藝周期內(nèi)，自身生長代謝是否有跡可循，表達產(chǎn)物是否均一可控。

與“穩(wěn)定細胞株”中“穩(wěn)定”是指相對瞬時表達而言的概念一致，細胞穩(wěn)定性研究應(yīng)當考察候選細胞株在模擬實際生產(chǎn)工藝及規(guī)模下的穩(wěn)定性，包括細胞水平、基因水平以及蛋白水平。我們可以明確，對于細胞株的穩(wěn)定性考察是有范圍和區(qū)間的，而在早期細胞株構(gòu)建階段，評估細胞株穩(wěn)定性使用原始細胞庫（PCB）作為起點連續(xù)傳代，達到覆蓋未來商業(yè)化生產(chǎn)最大規(guī)模的代次。對于“代次”的界定，不同公司可能會有出入，私以為，以細胞倍增水平（PDL）計算細胞代次更能準確評估細胞穩(wěn)定性。由于細胞為指數(shù)分裂形式，一次傳代培養(yǎng)細胞PDL可以由以下公式計算：

連續(xù)傳代過程中，細胞的實際PDL為傳代PDL的累加，由此可規(guī)避使用傳代次數(shù)計算由傳代頻率和時間帶來的不確定性。在實際細胞株P(guān)CB穩(wěn)定性評估開始時，實際生產(chǎn)的規(guī)模和工藝可能尚未敲定，因此，PCB常規(guī)穩(wěn)定性考察一般模擬實際建庫及擴種工藝，使細胞在含篩選壓力或不含篩選壓力的條件下傳代60個PDL，計算60PDL的倍增水平足夠覆蓋20000L規(guī)模的生產(chǎn)代次。傳代完成后，同時復(fù)蘇PCB細胞（PDL定義為0）及傳代終末細胞（一般為PDL60），在同樣的條件下進行Fed-batch，細胞表達量升高或降低30%以內(nèi)，并且表達蛋白質(zhì)量未發(fā)生顯著漂移，認為該細胞株穩(wěn)定。通過多樣化的單克隆篩選策略，可大幅提高通過細胞株遺傳穩(wěn)定性評估的單克隆。

皓越?細胞株開發(fā)平臺單克隆穩(wěn)定性分布

▲FIGURE 2 皓越?細胞株開發(fā)平臺單克隆穩(wěn)定性分布
（截至2022年）

值得一提的是，關(guān)于細胞株穩(wěn)定性的評價，目前法規(guī)并未給出明確標準定義經(jīng)過具體多少PDL的傳代，或者細胞表達量的具體變化率，來規(guī)定某一細胞株的穩(wěn)定性如何，僅要求開展細胞遺傳穩(wěn)定性研究，并強調(diào)遺傳穩(wěn)定性的規(guī)范性，如“傳代穩(wěn)定性研究應(yīng)模擬實際生產(chǎn)條件(如擴增和生產(chǎn)階段加壓或不加壓，傳代周期、培養(yǎng)表達工藝條件等)、考察細胞水平、基因水平以及蛋白水平的穩(wěn)定性，明確生產(chǎn)限傳代次，特別需要注意的是上市申請時應(yīng)評估已開展的傳代穩(wěn)定性研究能否滿足商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)需求”?；诖耍瑢τ诩毎攴€(wěn)定性考察的現(xiàn)行業(yè)內(nèi)通用做法和標準我們有更多的思考空間。由于行業(yè)技術(shù)水平的進步，細胞株表達量相較過去已大幅提升，就常規(guī)的批次補料生產(chǎn)方式而言，實際商業(yè)化批次生產(chǎn)規(guī)模是否還需要到達20000L？在質(zhì)量可控的前提下，細胞株表達量變化超過了30%，是否一定意味著該細胞株不穩(wěn)定？如此種種，值得我們重視思考和進一步的探討，但無論如何，細胞株穩(wěn)定性評價的目的是十分明確的。隨著對宿主細胞研究的深入，技術(shù)的發(fā)展及評價手段的增加，立足于質(zhì)量可控性，細胞株穩(wěn)定性研究必將更加科學(xué)與全面，為后期的商業(yè)化生產(chǎn)情況予以更準確的提示，正是——可使夏蟲語冰，而不拘于時也。

參考文獻：

1、Maria J Wurm, Florian M Wurm. Naming CHO cells for bio-manufacturing: Genome plasticity and variant phenotypes of cell populations in bioreactors question the relevance of old names. Biotechnol J. 2021 Jul;16(7):e2100165.

2、Siciliano, M. J., Stallings, R. L., & Adair, G. M. (1985). The geneticmap of the Chinese hamster and the genetic consequences of chromosomal rearrangements in CHO cells. In: Gottesman, M. M. [ed] Molecular Cell Genetics, John Wiley and Sons. 95–135.

3、《生物技術(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制》（第三版），王軍志主編，科學(xué)出版社

4、周莉婷，羅建輝.《生物制品上市申請藥學(xué)申報資料常見問題和審評關(guān)注要點分析》. 《中國新藥雜志》2020,29(03)：264-268.

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