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文章導(dǎo)讀：自從新冠肺炎疫情出現(xiàn)后，mRNA就廣泛進(jìn)入大眾的視野。目前，鑒于肽表位的多樣性和I類(lèi)主要組織相容性復(fù)合物（MHCI）的多態(tài)性，將mRNA同時(shí)遞送到多個(gè)抗原（Ag）特異性CD8+T細(xì)胞群仍可視為一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

由于免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，向不同群體的Ag特異性T細(xì)胞的多重遞送仍然具有挑戰(zhàn)性。故Science期刊發(fā)表的一篇文章《In vivo mRNA delivery to virus-specific T cells by light-induced ligand exchange of MHC class I antigen-presenting nanoparticles》研究了如何通過(guò)光誘導(dǎo)MHC I類(lèi)抗原呈遞納米顆粒的配體交換來(lái)向病毒特異性T細(xì)胞遞送mRNA，即使用pMHCI分子，該分子用可光裂解的肽重折疊，以允許通過(guò)UV光進(jìn)行快速配體交換。

本文分為4個(gè)部分：

Part 1概述使用pMHCI形成T細(xì)胞背景；

Part 2使用pMHCI遞送T細(xì)胞研究方法；

Part 3講述APNs如何與Ag特異性T細(xì)胞結(jié)合，并誘導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)化；

Part 4得出結(jié)論——使用APN可有效將多重mRNA遞送至病毒特異性T細(xì)胞，可潛在擴(kuò)展以轉(zhuǎn)染更廣泛的Ag特異性T細(xì)胞亞群。

Part 01?使用pMHCI形成T細(xì)胞背景

我們知道，抗原（Ag）特異性CD8+T細(xì)胞表達(dá)T細(xì)胞受體（TCR），該受體識(shí)別與細(xì)胞表面表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合物I類(lèi)（MHCI）分子結(jié)合的加工肽Ag。TCR-肽-MHCI（pMHCI）相互作用形成了CD8+T細(xì)胞識(shí)別的精確特異性及其對(duì)攜帶同源pMHCI Ags的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的基礎(chǔ)。最近的研究包括免疫調(diào)節(jié)分子（如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-抑制劑）的傳遞，使用納米粒子修飾T細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體，包括CD3和細(xì)胞程序性死亡蛋白-1（PD-1），以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的效應(yīng)功能。

用載有核酸的聚合物/脂質(zhì)納米粒（LNPs）編程內(nèi)源性CD3+或CD8+T細(xì)胞，如CD45小干擾RNA（siRNA）和嵌合Ag受體（CAR）編碼的DNA可顯示出沉默T細(xì)胞靶基因或原位制造CAR T細(xì)胞的潛力。靶向Ag特異性T細(xì)胞的能力提供了在體內(nèi)選擇性增強(qiáng)疾病相關(guān)T細(xì)胞亞群的機(jī)會(huì)，同時(shí)維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)和自身耐受性。

為了在體內(nèi)靶向Ag特異性T細(xì)胞，策略包括工程化人pMHCI [人白細(xì)胞Ag（HLA）]-Fc融合二聚體以擴(kuò)增人乳頭瘤病毒（HPV）特異性CD8+T細(xì)胞以抵抗HPV相關(guān)惡性腫瘤或通過(guò)免疫正電子發(fā)射斷層掃描成像追蹤病毒特異性CD8+T細(xì)胞，由納米顆粒上的pMHCI或工程紅細(xì)胞組成的人工Ag呈遞細(xì)胞以激活A(yù)g特異性T細(xì)胞并增強(qiáng)其對(duì)癌癥治療的效應(yīng)功能，腫瘤靶向抗體以遞送被腫瘤蛋白酶切割的病毒肽，然后加載到腫瘤細(xì)胞表面的MHCI上，以將病毒特異性T細(xì)胞重定向至腫瘤，和用pMHCII分子修飾的納米顆粒將自身抗原反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞重編程為抑制疾病的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）。

Part 02 使用pMHCI遞送T細(xì)胞研究方法

傳統(tǒng)上，pMHCI分子通過(guò)單獨(dú)的重折疊反應(yīng)表達(dá)，以將三個(gè)組分（不變輕鏈、多態(tài)重鏈和肽配體）組裝到內(nèi)源性pMHCI的異三聚體結(jié)構(gòu)中。利用紫外光介導(dǎo)的肽交換，用含有光不穩(wěn)定基團(tuán)的犧牲肽重折疊重鏈和輕鏈，從而在紫外光光切割時(shí)，犧牲肽解離以允許交換肽結(jié)合到MHCI呈現(xiàn)凹槽。對(duì)于特定的MHC等位基因，一批對(duì)UV敏感的pMHCI分子可以按常規(guī)進(jìn)行重折疊，然后在實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生數(shù)百個(gè)攜帶不同肽的pMHC分子。

筆者團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了使用紫外光介導(dǎo)的配體交換合成的Ag呈遞納米顆粒（APNs），以將mRNA遞送到多個(gè)流感特異性CD8+T細(xì)胞。與抗體（如CD3和CD8）相比，文章使用的方法提高了T細(xì)胞遞送的精確度，可快速擴(kuò)展到不同的肽表位，并且通過(guò)mRNA遞送，將實(shí)現(xiàn)從T細(xì)胞治療的原位制造到基因組編輯和調(diào)節(jié)的一系列應(yīng)用。使用紫外光介導(dǎo)的配體交換從犧牲的pMHCI前體中產(chǎn)生一組pMHCI分子，該前體被脂尾位點(diǎn)特異性修飾。這允許肽交換后插入預(yù)先形成的LNPs，該LNPs封裝了編碼重鏈（VHH）抗體上駱駝單可變結(jié)構(gòu)域的模型mRNA報(bào)告子。然后筆者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，用常規(guī)重折疊或肽交換的pMHCI分子修飾的APN在體內(nèi)的多個(gè)TCR轉(zhuǎn)基因小鼠模型（P14、Pmel-1和OT-1）中可靶向和轉(zhuǎn)染Ag特異性CD8+T細(xì)胞，而不考慮MHC同種型（P14和Pmel的H2-Db和OT-1的H2-Kb）。在重組甲型流感病毒感染（用GP33Ag修飾的a/PuertoRico/8/34H1N1，縮寫(xiě)為PR8-GP33）的小鼠模型中，靜脈內(nèi)給藥肽交換APN（NP366/Db、PA224/Db和GP33/Db）的三重混合物導(dǎo)致了前三個(gè)免疫顯性PR8-GP33特異性T細(xì)胞群的同時(shí)轉(zhuǎn)染，與脾臟和肝臟中的其他主要細(xì)胞群相比，這一轉(zhuǎn)染效率顯著更高。文章數(shù)據(jù)表明，紫外光介導(dǎo)的肽交換允許APNs的平行產(chǎn)生，用于在體內(nèi)向多個(gè)Ag特異性CD8+T細(xì)胞群遞送功能性mRNA。

Part 03?APNs與Ag特異性T細(xì)胞結(jié)合，并誘導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)化

筆者團(tuán)隊(duì)采用的方法是用脂質(zhì)修飾的衍生物插入預(yù)制納米顆粒，用疏水相互作用穩(wěn)定的配體修飾納米顆粒。筆者團(tuán)隊(duì)首先試圖表達(dá)重組pMHCI分子，該分子具有用于脂質(zhì)綴合的位點(diǎn)特異性處理，使得復(fù)合物可以作為插入LNPs前肽交換的起點(diǎn)（圖1A）。然后用重鏈中的C端半胱氨酸表達(dá)并重折疊了淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)膜腦膜炎病毒（LCMV）Ag GP33/Db（KAVYNFATM/Db），以防止天然二硫鍵斷裂，并保持TCR識(shí)別的正確pMHCI取向。然后將它們與1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）-PEG2000馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)，生成脂質(zhì)修飾的GP33/Db分子。

同時(shí)通過(guò)微流體混合器合成了封裝增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）mRNA的基于MC3的LNP，其特征在于動(dòng)態(tài)光散射的平均直徑為93.85 nm，ζ電位為?30.20±0.5 mV（圖2A和B）。脂質(zhì)修飾的GP33/Db pMHCI分子插入后不會(huì)顯著增加LNP大小，也不會(huì)改變zeta電位（分別為107.9±7.34 nm和?22.73±4.7 mV）（圖2，B和C）。使用雙辛可寧酸（BCA）蛋白質(zhì)定量證實(shí)了各種APN制劑的成功插入后（表1）。筆者團(tuán)隊(duì)還使用RiboGreen試驗(yàn)評(píng)估了eGFP mRNA濃度，并發(fā)現(xiàn)裸LNP和APN相當(dāng)（分別為80.20±0.50%至73.62±0.58%）（圖1C）。

隨即，筆者團(tuán)隊(duì)測(cè)試了GP33/Db APNs是否可以選擇性地與從TCR轉(zhuǎn)基因P14小鼠分離的同源CD8+T細(xì)胞結(jié)合，該小鼠的CD8+T表達(dá)特異性識(shí)別LCMV GP33/Db-Ag的TCR（圖3A）。然后發(fā)現(xiàn)GP33/Db APNs與約97%的P14 CD8+T細(xì)胞結(jié)合，而非昆蟲(chóng)GP100/Db（KVPRNQDWL/Db）APNs顯示出最小的染色（3.22%）（圖3B）。然后進(jìn)一步使用H2 Kb限制性O(shè)VA/Kb（SIINFEKL/Kb）APN測(cè)試APN結(jié)合，并觀察到與非編碼NS2/Kb（RTFSFSQLI/Kb）的APN相比，當(dāng)與從OT-1轉(zhuǎn)基因小鼠分離的同源CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，類(lèi)似的Ag特異性結(jié)合（圖3C）。發(fā)現(xiàn)NS2/Kb APN對(duì)OT-1 CD8+脾細(xì)胞的10%交叉反應(yīng)性可能是由于H2-Kb MHC對(duì)CD8+T細(xì)胞上CD8共受體的結(jié)合親和力。

僅有此不足以完全證明假設(shè)，于是筆者團(tuán)隊(duì)接下來(lái)研究了APN與T細(xì)胞的結(jié)合是否會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞內(nèi)化，因?yàn)橐阎猵MHCI多聚體在生理溫度下通過(guò)TCR聚集和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被T細(xì)胞快速吸收。發(fā)現(xiàn)在4°C下孵育的細(xì)胞的DiD熒光降低，表明APN在酸洗前保留在細(xì)胞表面（圖3，D和E）。但在在37°C下處理的細(xì)胞，熒光沒(méi)有變化，表明APN的有效T細(xì)胞內(nèi)化。

相比之下，筆者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在所有條件下，OT-1 CD8+T細(xì)胞均未結(jié)合和內(nèi)化非昆蟲(chóng)GP100/Db APNs（圖3E）。為了確定pMHCI誘導(dǎo)的TCR內(nèi)化是否會(huì)導(dǎo)致向T細(xì)胞傳遞功能性mRNA，文章使用了負(fù)載eGFP mRNA的GP33/Db APN孵育P14脾細(xì)胞。與用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS；MFI，153）或游離mRNA（MFI，118）處理的脾細(xì)胞相比，觀察到APN轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞的eGFP表達(dá)呈劑量依賴(lài)性[平均熒光強(qiáng)度（MFI）分別為397和506，分別為1和2μg mRNA劑量]（圖3F）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同源APNs靶向、結(jié)合和誘導(dǎo)T細(xì)胞攝取，以在體外傳遞功能性mRNA。

在有上述實(shí)驗(yàn)做基礎(chǔ)后，筆者團(tuán)隊(duì)接下來(lái)量化了TCR轉(zhuǎn)基因P14小鼠中GP33/Db APN的體內(nèi)生物分布和轉(zhuǎn)染效率（圖4A）。文章使用了負(fù)載有螢火蟲(chóng)熒光素酶（Fluc）mRNA的APN測(cè)試了向主要器官的功能遞送（圖4，B和C）。發(fā)現(xiàn)與非昆蟲(chóng)GP100/Db APN相比，從用GP33/Db APNs處理的小鼠分離的脾臟中的發(fā)光顯著更高。值得注意的是，兩組之間的其他主要器官?zèng)]有觀察到顯著差異。為了量化向T細(xì)胞的遞送，筆者團(tuán)隊(duì)在輸注封裝VHH mRNA的DiD標(biāo)記的APN 24小時(shí)后收獲P14脾細(xì)胞，并觀察到同源GP33/Db APN靶向P14 CD8+T細(xì)胞的>95%，而GP100/Db APP對(duì)照導(dǎo)致<2%的結(jié)合，如DiD熒光所量化的（圖4D）。為了量化功能性遞送，筆者團(tuán)隊(duì)使用編碼糖基磷脂酰肌醇（GPI）膜錨定VHH的mRNA作為報(bào)告基因，因已證明其可實(shí)現(xiàn)持久的表面表達(dá)（>28天），可以通過(guò)抗VHH抗體的免疫熒光染色來(lái)檢測(cè)。然后對(duì)VHH的表面表達(dá)進(jìn)行染色，并發(fā)現(xiàn)GP33/Db APNs與其非致癌物對(duì)應(yīng)物相比，導(dǎo)致顯著更高的轉(zhuǎn)染效率（圖4，E和F）。值得注意的是，在用GP33/Db APN或GP100/Db APNs處理的小鼠中觀察到CD8-脾細(xì)胞的轉(zhuǎn)染（<2%）可忽略不計(jì)。結(jié)合通過(guò)IVIS成像在器官水平觀察到的結(jié)果（圖4，B和C），數(shù)據(jù)表明，在脾臟中觀察到的Fluc發(fā)光主要來(lái)自同源CD8+脾細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。文章中使用Pmel小鼠在不同的模型中進(jìn)一步證實(shí)了此結(jié)果，該小鼠已被工程化以表達(dá)針對(duì)GP100/Db的同源TCR。

與之前在P14小鼠中的結(jié)果類(lèi)似，觀察到用GP100/Db APNs處理的Pmel CD8+脾細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)染約30 %至40 %，而用GP33/Db非致癌APNs轉(zhuǎn)染約3 %（圖5）。總之，這些結(jié)果表明APNs能夠以Ag特異性方式實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞靶向和功能性mRNA遞送。

Part 04?結(jié)論

Ag特異性CD8+T細(xì)胞是獲得性免疫的關(guān)鍵參與者，其直接殺死表達(dá)限制于MHCI呈遞的同源肽Ags的靶細(xì)胞的能力，正用于細(xì)胞療法、疫苗和自身免疫中。文章開(kāi)發(fā)了用于使用UV介導(dǎo)的肽交換將多重mRNA遞送至Ag特異性T細(xì)胞的APN，以加速針對(duì)一組肽表位的APN的產(chǎn)生。

APN適用于其他pMHCI分子，包括由人CD8+T細(xì)胞表達(dá)的HLA。且APN在轉(zhuǎn)染多種病毒特異性T細(xì)胞群中的能力可用于誘導(dǎo)病毒特異性T細(xì)胞的體內(nèi)增殖以治療病毒介導(dǎo)的癌癥。除CD8+T細(xì)胞外，通過(guò)用pMHCII產(chǎn)生APN，有可能將APN的轉(zhuǎn)染能力擴(kuò)展到CD4+T細(xì)胞。通過(guò)文章數(shù)據(jù)可知，使用APN可有效將多重mRNA遞送至病毒特異性T細(xì)胞，可潛在擴(kuò)展以轉(zhuǎn)染更廣泛的Ag特異性T細(xì)胞亞群。

參考文獻(xiàn)

[1] FANG-YI-SU, QINGYANG HENRY ZHAO,etc, In vivo mRNA delivery to virus-specific T cells by light-in-duced ligand exchange of MHC class l antigen-present-ing nanoparticles，2022.02.23.