Cy5.5單琥珀酰亞基酯?Cy5.5 NHS酯背景：

多種花青?5.5 (Cy5.5?)?染料已用于標(biāo)記生物分子，用于熒光成像和其他基于熒光的生化分析。它們廣泛用于標(biāo)記肽、蛋白質(zhì)和寡核苷酸等。Cy5.5??染料是最常見(jiàn)的紅色熒光團(tuán)之一。Cy5.5? NHS?酯很容易與氨基反應(yīng)。AAT Bioquest?提供三乙銨鹽形式的?Cy?染料?NHS?酯，與其他一些供應(yīng)商提供的相應(yīng)鉀鹽相比，它們更易溶于?DMSO?和?DMF。Cy?染料三乙基銨鹽具有相同的反應(yīng)性，并得到與?Cy?染料鉀鹽相同的綴合物。Cy5.5??是?GE Healthcare?的商標(biāo)。

1.?蛋白質(zhì)原液（溶液?A）

將?100 μL?反應(yīng)緩沖液（例如，1 M?碳酸鈉溶液或?1 M?磷酸鹽緩沖液，pH ~9.0）與?900 μL?目標(biāo)蛋白溶液（例如抗體，如果可能，蛋白濃度?>2 mg/mL）混合，得到?1 mL?蛋白質(zhì)標(biāo)記原液。注意：蛋白質(zhì)溶液（溶液?A）的?pH?值應(yīng)為?8.5?±?0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的?pH?值低于?8.0，則使用?1 M?碳酸氫鈉溶液或?1 M pH 9.0?磷酸鹽緩沖液將?pH?值調(diào)節(jié)到?8.0-9.0?的范圍內(nèi)。筆記：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解在?1X?磷酸鹽緩沖鹽水?(PBS)，pH 7.2-7.4。如果蛋白質(zhì)溶解在?Tris?或甘氨酸緩沖液中，則必須對(duì)?1X PBS，pH 7.2-7.4?進(jìn)行透析，以去除廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（如硫酸銨和乙酸銨）。注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白?(BSA)?或明膠穩(wěn)定的抗體不會(huì)被很好地標(biāo)記。疊丨氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾偶聯(lián)反應(yīng)。疊氮化鈉或硫柳汞可以通過(guò)透析或離心柱去除以獲得最佳標(biāo)記結(jié)果。筆記：如果蛋白質(zhì)濃度低于?2 mg/mL，偶聯(lián)效率會(huì)顯著降低。為獲得最佳標(biāo)記效率，建議使用?2-10 mg/mL?的最終蛋白質(zhì)濃度范圍。

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2.?花青?5.5?單琥珀酰亞胺酯原液（溶液?B）

將無(wú)水?DMSO?添加到花青?5.5?單琥珀酰亞胺酯的小瓶中，制成?10 mM?庫(kù)存溶液。通過(guò)移液或渦旋充分混合。注意：在開(kāi)始偶聯(lián)之前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液?B）。及時(shí)使用。染料儲(chǔ)備溶液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可能會(huì)降低染料活性。溶液?B?在避光和防潮的情況下可在冰箱中保存兩周。避免凍融循環(huán)。

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艾美捷Cy5.5單琥珀酰亞基酯?Cy5.5 NHS酯示例實(shí)驗(yàn)協(xié)議：

該標(biāo)記方案是為山羊抗小鼠?IgG?與花青?5.5?單琥珀酰亞胺酯的偶聯(lián)物而開(kāi)發(fā)的。您可能需要進(jìn)一步優(yōu)化您的特定蛋白質(zhì)。注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記可能對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會(huì)降低靈敏度。

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艾美捷Cy5.5單琥珀酰亞基酯?Cy5.5 NHS酯運(yùn)行偶聯(lián)反應(yīng)：

使用溶液?B（染料）/溶液?A（蛋白質(zhì)）的?10:1?摩爾比作為起點(diǎn)：將?5 μL?染料儲(chǔ)備溶液（溶液?B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為?10 mM）添加到蛋白質(zhì)小瓶中溶液（95 μL?溶液?A），有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為?10 mg/mL?且蛋白質(zhì)的分子量為?~200KD，則蛋白質(zhì)的濃度為?~0.05 mM。注意：我們建議使用溶液?B（染料）/溶液?A（蛋白質(zhì)）的?10:1?摩爾比。如果太少或太高，分別確定J佳染料/蛋白質(zhì)比例為?5:1、15:1?和?20:1。

在室溫下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物?30-60?分鐘。

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以下方案是使用?Sephadex G-25?柱純化染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的示例：

1.根據(jù)制造說(shuō)明制備?Sephadex G-25?色譜柱。

2.將反應(yīng)混合物（從“運(yùn)行共軛反應(yīng)”）加載到?Sephadex G-25?柱的頂部。

3.一旦樣品在頂部樹(shù)脂表面下方運(yùn)行，立即添加?PBS (pH 7.2-7.4)。

4.向所需樣品中添加更多?PBS (pH 7.2-7.4)?以完成色譜柱純化。將含有所需染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物的部分結(jié)合起來(lái)。注意：為了立即使用，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋?zhuān)⒎盅b以供多次使用。注意：為了長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液需要濃縮或冷凍干燥。