??? ? ?今天介紹的病毒是濃核病毒(Densovirus)的典型代表——黑胸大蠊?jié)夂瞬《?Periplaneta fuliginosa?Pefuambidensovirus，Periplaneta fuliginosa Densovirus，PfDNV)。

簡(jiǎn)介

? ? ? ? 黑胸大蠊?jié)夂瞬《?Periplaneta fuliginosa Pefuambidensovirus，Periplaneta fuliginosa Densovirus，PfDNV)是細(xì)小病毒科雙義濃核病毒屬(Ambidensovirus)中黑胸大蠊?jié)夂瞬《?Pefuambidensovirus)的唯一成員。

? ? ? ?PfDNV由胡遠(yuǎn)揚(yáng)等人從死亡的黑胸大蠊體內(nèi)分離，并于1991年首次對(duì)該病毒進(jìn)行了報(bào)道，使其成為世界上第一個(gè)正式分類鑒定的蟑螂濃核病毒。

? ? ? ?PfDNV可以高效、特異的殺滅黑胸大蠊，因此具有作為生物殺蟲(chóng)劑的能力。

病毒學(xué)特征

? ? ? ? PfDNV體積小，直徑為18~26納米，無(wú)包膜。病毒粒子為二十面體，三角對(duì)稱數(shù)T=1。在病毒粒子中有60個(gè)外殼蛋白拷貝。每個(gè)復(fù)制品都有一個(gè)被描述為“風(fēng)箏形楔子”的形狀，表面表面粗糙，有許多小突起。病毒粒子似乎不含脂質(zhì)。

? ? ? ?PfDNV表面較光滑、三重軸上存在小刺狀突起而無(wú)釘狀突起；五重軸上沒(méi)有五重軸通道，亦沒(méi)有峽谷區(qū)，但有類似于三重軸上的小刺狀結(jié)構(gòu)；兩重軸上存在酒窩樣凹陷，這些結(jié)構(gòu)不存在于其他細(xì)小病毒中。

? ? ? PfDNV是雙義的DNA病毒，其正義鏈與反義鏈分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)和衣殼蛋白(VP)。病毒粒子由60個(gè)衣殼蛋白亞基呈正二十面體對(duì)稱排列。衣殼蛋白具有保護(hù)病毒基因組、識(shí)別細(xì)胞表面受體、決定宿主特異性等功能。

? ? ? ?PfDNV末端序列存在201nt的倒置重復(fù)序列

(ITRs)。同時(shí)，病毒基因組兩末端均存在122nt的回文序列，但PfDNV的末端回文序列中不存在小的回文序列，不能形成“Y”或“T”型結(jié)構(gòu)，而是形成典型的棒狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在細(xì)小病毒基因組中，末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)與病毒的復(fù)制有密切的關(guān)系?？捎纱送茰y(cè)PfDNV的復(fù)制采取“自身引物，發(fā)夾轉(zhuǎn)移“的方式，首先以折疊的3端回文序列為引物合成病毒DNA中間體，最后通過(guò)特異性位點(diǎn)的切割而得到子代病毒DNA。

? ? ? ?黑胸大蠊?jié)夂瞬《净蚪M反義鏈編碼衣殼蛋白(VP)。病毒感染黑胸大蠊后其VP mRNAs經(jīng)由可變剪接產(chǎn)生。

? ? ? ?SDS-PAGE分析顯示病毒衣殼中含有五個(gè)衣殼蛋白，105kDa(VP5)、82kDa(VP4)、79kDa(VP3)、56kDa(VP2)、52kDa(VP1)。而對(duì)其VPmRNAs的序列分析顯示它們可編碼產(chǎn)生大小為52kDa(VP52)、65kDa(VP65)、85kDa(VP85)的三個(gè)候選衣殼蛋白。因此推測(cè)產(chǎn)生衣殼蛋白的數(shù)目與SDS-PAGE結(jié)果不一致。

? ? ? ?? 為了確定由mRNAs序列分析得出的VP52、VP65、VP85與SDS-PAGE顯示的VP1-5間的關(guān)系，人們用含病毒基因組的重組質(zhì)粒pUC119-PfDNV轉(zhuǎn)染黑胸大蠊幼蟲(chóng)獲得VP mRNAs后將所得VP52、VP65、VP85蛋白的開(kāi)放閱讀框(ORF)克隆入真核表達(dá)載體，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)相應(yīng)蛋白。在獲得VPmRNAs的過(guò)程中，在已知的剪接供體位點(diǎn)sd1、sd2、sd3和剪接受體位點(diǎn)sa1、sa2、sa3的基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)了額外的剪接供體位點(diǎn)sd4、sd5和剪接受體位點(diǎn)sa4;并在已知的五種PfDNV VP mRNAs

(sd1sa1&sd2sa2，sd1sal&sd2sa3，sd1sa1&sd3sa3，sd3sa3及未剪接VP mRNA)的基礎(chǔ)上另外發(fā)現(xiàn)了三種VPmRNAs(sd4sa1&sd2sa2，sd4sal&sd3sa3，sd1sa1&sd5sa4)。

? ? ? ?非常有趣的是，這三個(gè)新VP mRNAs無(wú)編碼新的候選衣殼蛋白的能力，即所有VP mRNAs仍只編碼產(chǎn)生VP52、VP65、VP85。通過(guò)表達(dá)的VP52、VP65、VP85蛋白與病毒粒子衣殼蛋白的western blot比較，VP52即VP2，VP65即VP3與VP4，VP85即VP5，我們認(rèn)為VP1是VP2(VP52)在病毒成熟后的N端水解產(chǎn)物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在6%SDS-PAGE電泳后western blot檢測(cè)時(shí)，VP3與VP4(VP65)顯示出四條帶；在VP65N端加入Flag標(biāo)簽、C端加入His標(biāo)簽后檢測(cè)時(shí)仍為四條帶，表明它們并非由VP65表達(dá)過(guò)程中N端降解或C端提前終止產(chǎn)生；因此VP65存在翻譯后修飾。對(duì)病毒粒子的酪氨酸磷酸化檢測(cè)結(jié)果表明，PfDNV VP蛋白存在酪氨酸磷酸化修飾；其中VP1的酪氨酸磷酸化最強(qiáng)，VP2(VP52)、VP3與VP4(VP65)的酪氨酸磷酸化較弱，VP5未檢測(cè)到磷酸化信號(hào)；然而在用去酪氨酸磷酸化酶(PTP)及去絲氨酸、蘇氨酸磷酸化酶（Lambda PP)處理時(shí)，真核表達(dá)的VP65的帶型并未改變，因此酪氨酸磷酸化并不是導(dǎo)致四條帶產(chǎn)生的原因。此外，對(duì)病毒粒子的泛素化檢測(cè)無(wú)信號(hào)，結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測(cè)還有其他類型的翻譯后修飾形式存在。由于VP52的序列完全位于VP65內(nèi)并且相同表達(dá)條件時(shí)VP52只有一條帶，因此我們認(rèn)為導(dǎo)致VP65產(chǎn)生四條帶的修飾位置在其獨(dú)有的N端113個(gè)氨基酸上。

? ? ? ? 由于直接利用PfDNV病毒粒子進(jìn)行各衣殼蛋白功能研究的可操作性較低，因此，在真核細(xì)胞中成功表達(dá)了VP52、VP65、VP85蛋白，并確定它們?yōu)镻fDNV衣殼蛋白后，人們進(jìn)一步研究了VP52、VP65、VP85蛋白在Sf9細(xì)胞中的分布及包裝情況。通過(guò)間接免疫熒光及分離細(xì)胞核、質(zhì)組分進(jìn)行westernblot的方法，我們發(fā)現(xiàn)VP52、VP65、VP85單獨(dú)在Sf9中表達(dá)時(shí)均可進(jìn)入細(xì)胞核；此外在VP65N端加入Flag標(biāo)簽或C端加入His標(biāo)簽或N端加入Flag標(biāo)簽的同時(shí)C端加入His標(biāo)簽時(shí)，都不影響VP65的核定位。通過(guò)PSORTII軟件分析發(fā)現(xiàn)VP52、VP65、VP85含有可能的共同核定位序列PPNKKAKT。為確定該序列是否有決定VP入核的功能，我們研究了一系列N端缺失的VP65蛋白的分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺失VP65N端242個(gè)氨基酸時(shí)不影響其在細(xì)胞內(nèi)的分布。因預(yù)測(cè)的核定位序列PNKKAKT位于VP65的143-150位，因此表明該序列不具備核定位功能。此外，人們還研究了缺失C端100個(gè)氨基酸的VP65的分布情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺失C端100個(gè)氨基酸時(shí)亦不影響VP65的分布。由此人們推測(cè)PfDNV VP上不存在典型的核定位信號(hào)，VP入核可能依靠其自身空間結(jié)構(gòu)上的信息或細(xì)胞因子的輔助作用。人們?cè)诖_定PfDNV VP可以入核后進(jìn)一步研究了這些入核的VP是否能夠包裝并最終形成病毒粒子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VP52、VP65、VP85單獨(dú)存在時(shí)都可以形成蛋白聚集體，而VP52、VP65單獨(dú)表達(dá)時(shí)皆可形成病毒類似粒子，VP85則不能。由此，人們認(rèn)為VP85不是病毒包裝所必需的。VP52、VP65、VP85混合表達(dá)時(shí)也可形成病毒類似粒子，并且所形成的病毒類似粒子似乎更接近于野生型病毒粒子。

病毒生活史

? ? ? ? 濃核病毒在宿主細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制、包裝。

1.附著到宿主受體開(kāi)始網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的病毒粒子內(nèi)吞進(jìn)入宿主細(xì)胞。

2.病毒粒子通過(guò)宿主內(nèi)體膜滲透進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。

3.病毒粒子向細(xì)胞核的微管運(yùn)輸。

4.病毒ssDNA基因組進(jìn)入細(xì)胞核。

5.ssDNA通過(guò)細(xì)胞蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為dsDNA。

6.當(dāng)宿主細(xì)胞進(jìn)入S期時(shí)，dsDNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒mrna，并翻譯產(chǎn)生病毒蛋白。

7.通過(guò)滾叉復(fù)制進(jìn)行復(fù)制，NS1內(nèi)切酶共價(jià)結(jié)合到5'基因組末端。

8.單個(gè)ssDNA基因組從復(fù)制串聯(lián)體中被切除的過(guò)程稱為連接分辨。

9.這些新合成的ssDNA也可以：

A)轉(zhuǎn)換為dsDNA，作為轉(zhuǎn)錄/復(fù)制的模板

B)被包被形成新的病毒粒子，并通過(guò)細(xì)胞裂解而釋放。