腫瘤疫苗可以促進(jìn)腫瘤特異性免疫刺激，是最重要的免疫治療策略之一，在腫瘤的治療/預(yù)防方面具有巨大的潛力。自體腫瘤細(xì)胞疫苗表現(xiàn)出比傳統(tǒng)疫苗更強(qiáng)的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)能力。然而，體外制備自體疫苗面臨程序復(fù)雜、產(chǎn)量低、療效不理想等問題，限制了自體癌疫苗的臨床應(yīng)用。因此，體內(nèi)成為了生產(chǎn)腫瘤疫苗的理想選擇。

東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院吳富根教授團(tuán)隊在Nature Communications上發(fā)表題為“In situ generation of micrometer-sized tumor cell-derived vesicles as autologous cancer vaccines for boosting systemic immune responses”的文章，研究團(tuán)隊制備了一系列納米炸彈（Nanobombs，NBs），包括負(fù)載阿霉素（DOX，抗癌藥物）和酪氨酸激酶抑制劑（TKI，抗癌藥物）和透明質(zhì)酸（HA，用于腫瘤靶向）包被的樹枝狀聚合物（Dendritic Polymers），稱為HDDT NBs。該納米炸彈具有~100%的將各種癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為微米大小囊泡（HMVs）的能力。荷瘤小鼠模型證實(shí)HDDT NBs不但能夠抑制腫瘤生長，并且能夠通過原位生產(chǎn)HMVs將原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)化為抗原庫，作為癌癥免疫治療的個性化疫苗。中科新生命為該研究提供了蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測服務(wù)。

?研究材料

多種腫瘤細(xì)胞系、4T1荷瘤BALB/c小鼠、黑色素瘤小鼠模型

?技術(shù)路線

步驟1：設(shè)計、表征HDDT NBs亞細(xì)并確定其細(xì)胞內(nèi)化及亞細(xì)胞分布；

步驟2：表征HDDA使用后腫瘤細(xì)胞系的結(jié)構(gòu)變化；

步驟3：挖掘HDDA的抗癌及HMV轉(zhuǎn)化機(jī)制；

步驟4：分析HDDA的體外ICD效應(yīng)和HMV的免疫刺激作用；

步驟5：分析HDDA的體內(nèi)抗腫瘤和免疫刺激作用；

步驟6：分析HDDA治療小鼠腫瘤組織中HMV產(chǎn)生的潛在機(jī)制；

步驟7：研究HDDA治療小鼠腫瘤后的全身免疫應(yīng)答；

步驟8：HDDA延緩黑色素瘤生長并促進(jìn)ICB治療。

?研究結(jié)果

1. HDDT NBs誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為HMV

研究團(tuán)隊在成功設(shè)計、表征HDDT NBs后進(jìn)一步確定了其能夠被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞。接下來，研究團(tuán)隊觀察了HDDA（具體酪氨酸激酶TKI為Apa，因此為HDDA）處理后4T1腫瘤細(xì)胞的形態(tài)變化。通過共聚焦成像發(fā)現(xiàn)幾乎所有的腫瘤細(xì)胞都失去了細(xì)胞結(jié)構(gòu)并轉(zhuǎn)化為HMV；通過SDS-PAGE證明HMV并非來源于單一的細(xì)胞器；使用活細(xì)胞成像確定了HMV的生產(chǎn)過程；基于BCA方法量化了HDDA處理后HMV的產(chǎn)量（圖1）。此外，研究團(tuán)隊使用多種腫瘤細(xì)胞系證明了HDDA能夠?qū)⒛[瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為HMV的普適性。

2. HMV的產(chǎn)生是細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的過程并可能具有免疫刺激作用

本研究使用的HDDA由酪氨酸激酶Apa、阿霉素DOX、透明質(zhì)酸HA和聚合物Dendritic Polymers組成。研究團(tuán)隊首先證明了完整HDDA對4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性要顯著高于游離單體或非完整體。由于ROS水平是DOX介導(dǎo)化療的重要標(biāo)志物，接下來，研究團(tuán)隊使用DCFH-DA ROS探針和細(xì)胞流式推斷HMV的產(chǎn)生是ROS和細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的過程（圖2）。

為了解釋HMV的形成機(jī)制，研究團(tuán)隊分析了HDDA處理前后的4T1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（圖2）。GO和KEGG富集結(jié)果顯示DEGs主要參與凋亡途徑、免疫應(yīng)答相關(guān)信號通路和ROS相關(guān)通路?；谵D(zhuǎn)錄組、ROS探針、細(xì)胞流式和其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究團(tuán)隊確認(rèn)HDDA可以誘導(dǎo)急性細(xì)胞凋亡并影響4T1細(xì)胞的基本細(xì)胞功能。

研究團(tuán)隊接下來使用蛋白質(zhì)組學(xué)分析了HMV蛋白的表達(dá)情況（圖3）。結(jié)果顯示，相比于4T1細(xì)胞及超聲誘導(dǎo)的4T1細(xì)胞碎片（稱為“Soni”樣品），HMV丟失了大量蛋白，并且有超過500種蛋白出現(xiàn)了差異表達(dá)。在HMV中測到一些免疫系統(tǒng)相關(guān)蛋白，并且部分免疫相關(guān)蛋白在HMV中過表達(dá)，此外GO和KEGG富集分析也檢測到一些免疫相關(guān)蛋白，這可能是HMV具有強(qiáng)免疫刺激作用的原因。

3. HDDA誘導(dǎo)4T1細(xì)胞的ICD并刺激DC成熟和巨噬細(xì)胞M1樣極化

為了分析HDDA誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解及HMV產(chǎn)生是否屬于ICD（免疫原性細(xì)胞死亡），研究團(tuán)隊檢測了三種重要的危險相關(guān)分子模式（DAMPs），即CRT、HMGB1和ATP，的釋放。細(xì)胞流式、ELISA和熒光素實(shí)驗(yàn)證明了HDDA處理后三種DAMPs的高表達(dá)，說明HDDA能夠通過增強(qiáng)DAMPs的釋放誘導(dǎo)4T1細(xì)胞的ICD。

經(jīng)歷ICD的腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生“吃己”信號，并將其呈遞給未成熟的DC刺激DC成熟并負(fù)責(zé)刺激免疫系統(tǒng)。此外，HDDA處理產(chǎn)生的HMV攜帶這種DAMP（CRT），并且HMV表面可能具有腫瘤特異性腫瘤相關(guān)抗原（TAA），因此，HMV可能作為癌癥免疫治療的自體腫瘤細(xì)胞疫苗。接下來，研究了HDDA處理細(xì)胞后誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞（DC）成熟和巨噬細(xì)胞M1樣極化（圖4a下）。細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于對照組和非完整HDDA組，完整HDDA處理的4T1細(xì)胞能夠刺激DC細(xì)胞的成熟和巨噬細(xì)胞的M1樣極化（圖4）。

4. 小鼠模型證明HDDA在體內(nèi)具有抗腫瘤和免疫刺激作用

研究團(tuán)隊使用4T1荷瘤BALB/c小鼠評估HDDA的體內(nèi)抗腫瘤功效。HDDA治療顯示出比其他藥物最顯著的腫瘤抑制效果，并且HDDA組中很大一部分腫瘤組織被破壞，證明了HDDA具有顯著的腫瘤消融能力。此外，在HDDA組中觀察到最多的TUNEL檢測試劑盒染色綠色熒光信號，表明HDDA處理小鼠腫瘤組織中凋亡細(xì)胞的比率最高。

基于體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究團(tuán)隊隨后研究了HDDA處理小鼠腫瘤組織中原位HMV的產(chǎn)生。使用電子顯微鏡觀察和抗CD44-異硫氰酸熒光素染色大量囊泡，證明HDDA處理后HMV在腫瘤組織的原位產(chǎn)生。

接下來，研究團(tuán)隊推測HDDA誘導(dǎo)的HMV可能有作為抗腫瘤免疫刺激的癌癥疫苗的潛力，因此評估了HDDA處理后體內(nèi)的ICD、DC細(xì)胞、TAM細(xì)胞、T細(xì)胞、細(xì)胞因子的效應(yīng)變化?；诳贵w熒光染色、ELISA、細(xì)胞流式等實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步表明HDDA具有很強(qiáng)的免疫刺激作用（圖5）。 總之，HDDA可以將免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（TME）轉(zhuǎn)化為促炎和殺瘤的TME。

5. 轉(zhuǎn)錄組證明HDDA誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡可以誘導(dǎo)免疫刺激

為了進(jìn)一步了解HDDA的抗腫瘤和免疫刺激作用以及HDDA治療小鼠腫瘤組織中HMV產(chǎn)生的潛在機(jī)制，工作人員已PBS處理對照組研究了HDDA處理后4T1腫瘤組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征。共檢測到1396個DEGs，并對這些DEGs進(jìn)行了GO和KEGG富集分析 。GO富集分析顯示，HDDA處理后腫瘤細(xì)胞的生長和一些基本細(xì)胞功能（如生長因子活性、ROS代謝過程、蛋白質(zhì)分泌、受體配體活性和酶抑制劑活性）受到影響。更重要的是，發(fā)現(xiàn)HDDA治療組中的大多數(shù)DEGs富含炎癥信號通路和免疫反應(yīng)相關(guān)信號通路。此外，KEGG富集分析進(jìn)一步說明了HDDA處理后免疫反應(yīng)相關(guān)信號通路?？偟膩碚f，HDDA處理小鼠腫瘤組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析進(jìn)一步表明，HDDA誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡可以誘導(dǎo)免疫刺激。

6. ?HDDA增強(qiáng)全身抗腫瘤免疫應(yīng)答，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移

基于體內(nèi)HDDA治療后的局部抗腫瘤免疫反應(yīng)，工作人員接下來研究了HMV是否可以誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫反應(yīng)。從4T1的BALB/c小鼠中取出引瘤淋巴結(jié)（TDLNs）和脾臟，經(jīng)治療后，使用細(xì)胞流式證明成熟DC細(xì)胞和M1樣巨噬細(xì)胞的比例均升高。使用同樣的方法證明了抗腫瘤T細(xì)胞免疫應(yīng)答的升高。使用ELISA證明了治療后促炎因子水平升高和抗炎因子水平降低?？偟膩碚f，HDDA治療可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗腫瘤全身免疫反應(yīng)。

此外，為了研究HDDA誘導(dǎo)的全身免疫反應(yīng)是否持久，研究團(tuán)隊重新挑戰(zhàn)了用4T1細(xì)胞在通過皮下或靜脈注射方式存活的荷瘤小鼠進(jìn)行HDDA治療。結(jié)果顯示，在HDDA組中，小鼠皮下腫瘤的生長幾乎完全被抑制，HDDA組的所有小鼠在40天內(nèi)存活，并且在肺部未觀察到腫瘤結(jié)節(jié)（圖7）。所有的結(jié)果均表明HDDA可以誘導(dǎo)持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

7. ?HDDA延緩黑色素瘤生長并促進(jìn)ICB治療

受乳腺癌模型中免疫刺激作用的鼓舞，研究團(tuán)隊使用高度侵襲性和免疫原性差的B16F10黑色素瘤模型進(jìn)一步研究了HDDA的抗癌性能，并引入了ICB療法。結(jié)果表明，單獨(dú)使用抗PD-1治療僅略微抑制腫瘤生長（圖8）。相比之下，“HDDA+抗PD-1”治療顯示抑制了黑色素瘤的生長速度并提高了小鼠的生存期。之后，為了研究HDDA是否可以在B16F10黑色素瘤模型中引發(fā)全身抗腫瘤免疫應(yīng)答，評估了治療后TDLN和脾臟中的免疫細(xì)胞組成。結(jié)果證明，“HDDA +抗PD-1”治療后TDLN和脾臟中成熟DC、CD4+和CD8+ T細(xì)胞的比例均顯著上調(diào)。以上結(jié)果證實(shí)，“HDDA+抗PD-1”在免疫原性較差的黑色素瘤模型中可誘導(dǎo)較強(qiáng)的全身抗腫瘤免疫應(yīng)答。

為了研究HDDA是否對腫瘤具有預(yù)防作用，作者將“HDDA +抗PD-1”治愈的小鼠靜脈重新激活B16F10腫瘤細(xì)胞，將未處理的小鼠設(shè)置為對照組。值得注意的是，靜脈再激活后未觀察到肺部腫瘤結(jié)節(jié)，證明了“HDDA +抗PD-1”治愈小鼠的強(qiáng)烈免疫記憶效應(yīng)。

?小結(jié)

在這項研究中，工作人員開發(fā)了一種基于HDDT NBs的策略以誘導(dǎo)強(qiáng)大的癌細(xì)胞死亡。重要的是，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為HMV，在腫瘤區(qū)域積累，穩(wěn)定的誘導(dǎo)ICD，逆轉(zhuǎn)免疫抑制TME。結(jié)果，腫瘤組織被轉(zhuǎn)化為自體疫苗庫，觸發(fā)全身腫瘤特異性免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)可被用于ICB治療應(yīng)答。此外，HDDA可以在治愈小鼠中建立強(qiáng)大的免疫記憶，可以有效地保護(hù)治愈小鼠免受腫瘤再挑戰(zhàn)。

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