貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開(kāi)始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

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貼壁細(xì)胞因其培養(yǎng)過(guò)程較為繁瑣，所以培養(yǎng)時(shí)更容易出現(xiàn)問(wèn)題。以下總結(jié)了貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的6種問(wèn)題，并詳細(xì)介紹原因和解決方法，若培養(yǎng)時(shí)遇到這些情況，可參考對(duì)應(yīng)解決方法處理。

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01

傳代后細(xì)胞全部飄起

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解決方法：檢查所使用的培養(yǎng)基的顏色是否偏紫色（如圖1），檢查瓶蓋是否透氣，不透氣瓶蓋是否被擰松。

通常培養(yǎng)基偏堿，顏色就會(huì)偏紫，主要是因?yàn)榕囵B(yǎng)基里的酚紅指示劑遇酸變黃、遇堿變紫，培養(yǎng)基量太少，或培養(yǎng)基存放時(shí)間太長(zhǎng)時(shí)都會(huì)變堿。建議配好完全培養(yǎng)基后分裝到50mL離心管并于一周內(nèi)用完，量少時(shí)放到15mL離心管里保存。

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02

傳代后部分細(xì)胞漂浮

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原因及解決方法如下

1）傳代前細(xì)胞密度太大：一般細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)可進(jìn)行傳代操作，傳代密度需適中，傳代密度過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致傳代后漂浮；

2）細(xì)胞狀態(tài)不好：可通過(guò)提高血清比例、穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境等方法進(jìn)行改善；

3）吹打次數(shù)過(guò)多造成機(jī)械損傷：輕柔吹打，細(xì)胞呈單顆粒時(shí)可停止吹打，吹打過(guò)程避免氣泡產(chǎn)生；

4）培養(yǎng)基更換后不適應(yīng)：更換回原來(lái)的培養(yǎng)基；或者與原培養(yǎng)基比例混合后使用，使細(xì)胞有個(gè)適應(yīng)期。

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03

傳代后細(xì)胞變形

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原因及解決方法如下

1）變形，但細(xì)胞還在生長(zhǎng)：可能是血清批次不一樣導(dǎo)致，血清成分復(fù)雜，不同批次和品牌間均存在成分差異，影響細(xì)胞狀態(tài)。建議使用同一批次血清，更換血清時(shí)需與原血清比例混合后使用，使細(xì)胞有過(guò)渡期；

2）變形，但細(xì)胞不長(zhǎng)，且碎片增多：可能傳代操作過(guò)程損傷，常見(jiàn)于消化不當(dāng)，或者潛在支原體等污染導(dǎo)致細(xì)胞病態(tài)；消化時(shí)間根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的狀態(tài)來(lái)調(diào)整，消化過(guò)度或者消化不充分均會(huì)對(duì)細(xì)胞造成影響；培養(yǎng)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，實(shí)驗(yàn)環(huán)境盡量潔凈，確保細(xì)胞無(wú)外源污染。

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04

細(xì)胞生長(zhǎng)周期變慢，邊養(yǎng)邊漂

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原因及解決方法如下

1）細(xì)胞傳代時(shí)密度太稀或太密：建議細(xì)胞密度達(dá)80%左右進(jìn)行傳代，傳代密度適中，密度過(guò)低會(huì)延長(zhǎng)生長(zhǎng)周期；

2）傳代操作不當(dāng)：根據(jù)細(xì)胞特性決定細(xì)胞消化時(shí)間，一般在顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓并有少量細(xì)胞脫落即可終止消化，難消化的細(xì)胞可分次消化，每次時(shí)間不超過(guò)5min；頻繁換液或者清洗細(xì)胞也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差，常規(guī)換液時(shí)間間隔為2~3天。

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05

傳代后細(xì)胞成團(tuán)

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解決方法如下

1）低密度接種，延長(zhǎng)換液時(shí)間，防止細(xì)胞脫落；

2）使用多聚賴(lài)氨酸包被培養(yǎng)器皿，以增加細(xì)胞貼壁牢固度，降低細(xì)胞聚集成團(tuán)的幾率；

3）重新鋪板，并更換新配制的培養(yǎng)基，加大血清比例（增加比例不超過(guò)5%）；

4）接種時(shí)，減少培養(yǎng)基量（如T25加3mL）以加快細(xì)胞貼壁速度，等待細(xì)胞貼壁后（約8-12小時(shí)），再補(bǔ)加培養(yǎng)基到正常用量。

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06

細(xì)胞出現(xiàn)空泡

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原因及解決方法如下

1）正常的細(xì)胞活動(dòng)：有的細(xì)胞有正常的自噬行為或其他膜泡活動(dòng)，無(wú)需特殊處理（如Caco-2細(xì)胞）；

2）血清不適應(yīng)、培養(yǎng)基成分改變、換液不及時(shí)等造成細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良：可通過(guò)更換更合適的血清或及時(shí)換液等方法解決；

3）機(jī)械損傷、PH偏高或偏低等造成細(xì)胞受損：注意培養(yǎng)條件及操作手法。