前言

2022年1月，中央研究院化學(xué)研究所陳擁軍團(tuán)隊(duì)在Nature Communications發(fā)表的題為“Streamlined single-cell proteomics by an integrated microfluidic chip and data-independent acquisition mass spectrometry”的研究成果，本研究將用于一體化蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備的微流控芯片和用于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析的數(shù)據(jù)非依賴性采集（DIA）質(zhì)譜相結(jié)合（chip-DIA），在20個哺乳動物細(xì)胞中平均分析約1500個蛋白質(zhì)；并應(yīng)用chip-DIA工作流程來分析貼壁和非貼壁惡性細(xì)胞的蛋白質(zhì)組，實(shí)現(xiàn)了5個數(shù)量級的動態(tài)范圍的檢出，具有良好的重現(xiàn)性。Chip-DIA工作流程提供了一體化的細(xì)胞表征、分析靈敏度和準(zhǔn)確性，并可在未來增加其他功能，從而為先進(jìn)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

中文標(biāo)題：通過集成微流控芯片和DIA質(zhì)譜簡化單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究

研究對象：人肺腺癌細(xì)胞系PC-9、人B-CLL細(xì)胞系MEC-1

發(fā)表期刊：Nature Communications

影響因子：14.919

發(fā)表時間：2022年1月10日

研究單位：中央研究院化學(xué)研究所

運(yùn)用生物技術(shù)：單細(xì)胞蛋白組學(xué)

研究背景

基于單細(xì)胞組學(xué)的快速發(fā)展徹底改變了現(xiàn)代生物學(xué)研究，但由于蛋白質(zhì)組成分的動態(tài)范圍很寬，并且缺乏可行的蛋白質(zhì)擴(kuò)增策略，蛋白質(zhì)組學(xué)分析的靈敏度受到限制?；谫|(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)方法具有高特異性、高覆蓋率和無需標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，在一些研究中已被證明可以達(dá)到單細(xì)胞靈敏度。在大多數(shù)傳統(tǒng)的質(zhì)譜工作流程中，很多步驟處理會導(dǎo)致樣品的顯著損失，因此微量樣品的微蛋白質(zhì)組學(xué)的工作流程被廣泛開發(fā)，目前已經(jīng)可以將基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)分析擴(kuò)展到有限的輸入樣品中（<1000個細(xì)胞）。然而，從多重細(xì)胞捕獲和成像、細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)酶切到肽脫鹽的全自動工作流程尚未建立，因此，在本研究中，構(gòu)建了具有不同細(xì)胞容量的芯片，以促進(jìn)不同細(xì)胞輸入的最佳分析深度的實(shí)驗(yàn)，同時展示了具有一體化功能的微流體設(shè)備，以實(shí)現(xiàn)自動化和簡化的蛋白質(zhì)組學(xué)制備，為有限的輸入樣品（包括單個細(xì)胞）提供高靈敏度和可重復(fù)性。

研究思路

研究結(jié)果

集成蛋白質(zhì)組學(xué)芯片的設(shè)計和表征以及簡化的微蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程

為了給質(zhì)量有限的樣品提供簡化的微蛋白質(zhì)組學(xué)流程，作者設(shè)計了一種微流體裝置作為集成蛋白質(zhì)組學(xué)芯片（iProChip，圖1），以提供從細(xì)胞輸入到完整的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品處理的一體化功能。為了提高蛋白質(zhì)組的覆蓋率，采用了一種深度的單次分析策略，利用Orbitrap質(zhì)譜儀整合了DIA分析。同時開發(fā)了一個由混合DDA-DIA數(shù)據(jù)集補(bǔ)充建立的光譜庫資源，使用的是由不同蛋白質(zhì)組組成的癌細(xì)胞系或免疫細(xì)胞系，它可以作為數(shù)字地圖，理論上恢復(fù)DIA數(shù)據(jù)的m/z和保留時間域中的所有肽信息。

詳細(xì)地說，就是對由不同細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞系構(gòu)建的光譜庫進(jìn)行了測試和優(yōu)化，以最大限度地增加識別和量化的蛋白質(zhì)數(shù)量。與外部獨(dú)立細(xì)胞分選儀相比，這個裝置的內(nèi)置模塊可提供簡單、快速和高效的細(xì)胞分離。作者還試圖表征試劑是否可以在細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)消化過程中在封閉的容器中有效混合，結(jié)果表明，渦旋、振蕩和擴(kuò)散混合這三種混合策略都足以適應(yīng)反應(yīng)動力學(xué)，且都符合進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程的時間尺度。

圖1 | 集成蛋白質(zhì)組學(xué)芯片示意圖和微量蛋白質(zhì)組學(xué)的簡化工作流程

iProChip與DIA質(zhì)譜的聯(lián)用

為了在蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程中操作iProChip，作者使用內(nèi)置細(xì)胞捕獲器捕獲精確數(shù)量的細(xì)胞，包括1、5、10、50和100個細(xì)胞。同時作者使用一種緩沖液實(shí)現(xiàn)了一鍋細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)還原和烷基化，以最大程度地減少樣品損失。在每次實(shí)驗(yàn)之前，作者強(qiáng)調(diào)需要將細(xì)胞室和反應(yīng)容器涂有牛血清白蛋白（BSA），以盡量減少肽的吸附損失。對于隨后的液相色譜（LC）–MS/MS分析，優(yōu)化了單次DIA-MS采集參數(shù)，包括分離窗口、分辨率、肽量和LC–MS/MS梯度，以增強(qiáng)低數(shù)量細(xì)胞中的蛋白質(zhì)組學(xué)譜分析覆蓋率。

為了允許DIA對低豐度和癌癥相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行深度分析，使用了肺癌和人類慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系構(gòu)建了高質(zhì)量的特異性光譜庫。為了評估基于DIA的iProChip定量的性能，作者使用iProChip處理13–14個PC-9細(xì)胞，并與傳統(tǒng)的DDA方法進(jìn)行了比較，系統(tǒng)地分析了靈敏度、蛋白質(zhì)組覆蓋率和重現(xiàn)性的優(yōu)勢（圖2）。

結(jié)果表明由直接DIA（dirDIA）和文庫輔助DIA（libDIA）互補(bǔ)處理的單次基于DIA的LC-MS/MS提高了iProChip中全自動樣品制備的小規(guī)模樣品的蛋白質(zhì)組鑒定覆蓋率。為了評估iProChip-DIA工作流程的再現(xiàn)性，作者計算了14個PC-9細(xì)胞的一式三份分析之間重疊蛋白質(zhì)的百分比。結(jié)果表明，iProChip-DIA方法具有更高的重現(xiàn)性和蛋白質(zhì)組覆蓋率。

圖2 | 通過DIA和DDA方法比較PC-9細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析的鑒定覆蓋率和定量性能

通過iProChip和DIA-MS對質(zhì)量有限的樣品進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組分析

接下來，作者系統(tǒng)地評估了iProChip-DIA在具有10，50和100個阱的腔室中對PC-9細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的性能情況，結(jié)果表明，iProChip-DIA在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中具有較高的靈敏度。為了將iProChip與散裝樣品處理進(jìn)行比較，作者直接在小瓶中處理了約100個細(xì)胞，通過注入對應(yīng)于1.5ng（10個細(xì)胞）和15個ng（100個細(xì)胞）的小等分試樣進(jìn)行DIA分析，與小瓶（50μg裂解物）中基于稀釋的處理進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)從iProChip工作流程中獲得的鑒定量在1.5 ng時增加了2倍。為了評估定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法的分析再現(xiàn)性，通過成對相關(guān)性分析對一式三份數(shù)據(jù)集中的蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行了定量比較。結(jié)果顯示，通過iProChip-DIA工作流程測量蛋白質(zhì)豐度，具有良好的再現(xiàn)性（圖 3）。

圖3 | iProChip-DIA在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中靈敏度、重現(xiàn)性和定量的分析性能

iProChip-DIA在白血病細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的應(yīng)用

從方法論開發(fā)的角度來看，代表異質(zhì)性癌癥類型的白血病細(xì)胞是開發(fā)敏感蛋白質(zhì)組學(xué)工具的理想模型，因此作者研究了iProChip-DIA在不同細(xì)胞數(shù)的MEC-1細(xì)胞上的應(yīng)用。結(jié)果表明iProChip-DIA進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定實(shí)現(xiàn)了良好的覆蓋率和重復(fù)性，iProChip-DIA平臺的一般適用性在人類B-CLL細(xì)胞系MEC-1上得到了證明（圖 4）。

圖4 | iProChip-DIA在MEC-1細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的應(yīng)用

通過單細(xì)胞集成蛋白質(zhì)組學(xué)芯片（SciProChip）和DIA質(zhì)譜增強(qiáng)靈敏度

受到蛋白質(zhì)組覆蓋和iProChip定量的結(jié)果啟發(fā)，作者接下來實(shí)現(xiàn)了iProChip專用于20個單細(xì)胞的復(fù)合物處理，稱之為單細(xì)胞iProChip（SciProChip）的技術(shù)。這種SciProChip被設(shè)計成包括20個腔室，每個腔室包含一個單細(xì)胞捕獲器，以方便精確和無人值守地捕獲一個細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)處理。通過對細(xì)胞誘捕器的最佳定位和較窄的腔室尺寸，該芯片顯示單細(xì)胞捕獲的細(xì)胞使用效率提高了約40%（圖 5）。

與iProChip相比，SciProChip的總處理量從312 nL減少到78.5 nL，C18填料柱的長度從2.5厘米減少到1厘米，這都有助于減少樣品損失。為了兼容小細(xì)胞的輸入，LC-MS/MS的梯度時間被減少到90分鐘。與iProChip相比，SciProChip顯示了更高的細(xì)胞使用效率和顯著提高的蛋白質(zhì)組覆蓋率，同時保持了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析的良好可重復(fù)性。

圖5 | 用于20-plex單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析的單細(xì)胞集成蛋白質(zhì)組學(xué)芯片（SciProChip）

研究結(jié)論

作者設(shè)計了兩種不同容量的芯片，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞分離、計數(shù)、成像和蛋白質(zhì)組學(xué)處理的一體自動化，用于深入的微蛋白質(zhì)組學(xué)（iProChip）鑒定以及單細(xì)胞水平（SciProChip）的定量?；诔叽绲姆诌x允許快速和可量化的細(xì)胞分離和成像，避免了使用外部細(xì)胞分選器的必要性，如熒光激活細(xì)胞分選。這樣一個精簡的策略規(guī)避了多步驟樣品轉(zhuǎn)移過程中樣品損失的限制，并最大限度地減少了傳統(tǒng)工作流程中的表面吸收，從而提高了蛋白質(zhì)組的敏感性和良好的可重復(fù)性。

小鹿推薦

常規(guī)的蛋白組學(xué)工作流程中，步驟繁瑣，樣品轉(zhuǎn)移過程中樣品損失很大。iProChip和SciProChip被設(shè)計成一個通用的、可擴(kuò)展的和強(qiáng)大的設(shè)備，不僅能夠很好地減少樣品損失，還具有高靈敏度、高重現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)有的蛋白質(zhì)組學(xué)方法可以很容易地集成到其中以適應(yīng)不同的應(yīng)用。

蛋白組學(xué)技術(shù)可以提供細(xì)胞狀態(tài)和調(diào)控的功能信息，本研究建立了單細(xì)胞蛋白組學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的蛋白組學(xué)檢測。該技術(shù)有助于揭示疾病的發(fā)病機(jī)制，探討預(yù)后和風(fēng)險相關(guān)的不同腎臟疾病亞型中的蛋白組學(xué)異質(zhì)性和獨(dú)特的蛋白標(biāo)志物，為藥物靶點(diǎn)治療提供希望。

大規(guī)模單細(xì)胞分析對于捕獲復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)中的生物異質(zhì)性至關(guān)重要，但僅基于RNA技術(shù)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)并不能很好地代表蛋白質(zhì)水平上的變化。而單細(xì)胞蛋白組學(xué)技術(shù)能夠從蛋白質(zhì)水平上破譯細(xì)胞機(jī)制并且獲得更多的信息。

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