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穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建

2021-11-17 11:51 作者:Cas9X海星生物 0人讀過(guò) | 我要投稿

?什么是穩(wěn)轉(zhuǎn)株？

穩(wěn)轉(zhuǎn)株即穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，指基于某一細(xì)胞系構(gòu)建的持續(xù)過(guò)表達(dá)或干擾某特定基因的細(xì)胞系。

為什么要建立穩(wěn)轉(zhuǎn)株？

①?通過(guò)建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，可以降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，方便在目的細(xì)胞中研究基因功能實(shí)驗(yàn)研究；

②?區(qū)別于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染只能干擾表達(dá)，無(wú)法去除已表達(dá)的目的蛋白，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系可以實(shí)現(xiàn)更好的基因干擾效果；③?瞬轉(zhuǎn)會(huì)引入極高拷貝數(shù)的表達(dá)，導(dǎo)致因人為因素造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不精確，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；④?需要用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的，主要是一些致死基因或者是需要時(shí)空表達(dá)的。

穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建原理

通過(guò)將外源DNA/shRNA克隆到帶有某種抗性基因的載體上，重組載體被轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞并整合到其染色體中，并能隨細(xì)胞分裂穩(wěn)定傳遞下去，再用載體中所含抗性基因進(jìn)行篩選。

穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建方法

目前常用到的方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和病毒轉(zhuǎn)染，病毒有慢病毒（Lentivirus），腺病毒（Adenovirus），逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）。??

影響穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立的因素?

?①?外源基因的整合率：決定了穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的難易程度；

②?插入外源基因片段的拷貝數(shù)：通常低拷貝或者單拷貝可以降低人為因素的干擾；

③?整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄活躍度：決定了穩(wěn)轉(zhuǎn)株中外源基因片段的表達(dá)質(zhì)量；

④?外源基因片段整合到細(xì)胞后的穩(wěn)定性：不同的整合位點(diǎn)決定了外源片段在染色體中的穩(wěn)定性，有些區(qū)域易發(fā)生重組或者丟失，從而使穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選后出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象。

穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立步驟?

|?病毒法

①?確定目標(biāo)細(xì)胞系的相關(guān)信息，細(xì)胞的培養(yǎng)條件，細(xì)胞的增值速度，支原體污染情況；

②?預(yù)實(shí)驗(yàn)確定MOI值，可通過(guò)查閱文獻(xiàn)確定慢病毒在目標(biāo)細(xì)胞系中的MOI值也可參考查閱得到的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)梯度實(shí)驗(yàn)，摸索最適MOI；

③?預(yù)實(shí)驗(yàn)確定篩選藥物用量，常用的藥物篩選有：puro、G418、潮霉素等；

④?細(xì)胞鋪板，將需要的細(xì)胞量接種于合適的培養(yǎng)皿中；

⑤?細(xì)胞感染，通過(guò)接種的細(xì)胞量及預(yù)實(shí)驗(yàn)得來(lái)的MOI來(lái)計(jì)算添加的病毒體積；

⑥?撤病毒，第二天，一般不超過(guò)24h換液；

⑦?轉(zhuǎn)染48h后選擇對(duì)應(yīng)的抗性藥物進(jìn)行篩選；

⑧?篩選結(jié)束后進(jìn)行單克隆化，選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)。

| VIRUS-Free?技術(shù)

VIRUS-Free??是一種利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建和篩選的技術(shù)，以替代慢病毒感染構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的技術(shù)。其載體中包括了轉(zhuǎn)座子的識(shí)別區(qū)域，在轉(zhuǎn)座酶的催化下，將目的片段從載體上或者BAC分子上切割下來(lái)形成一個(gè)小環(huán)結(jié)構(gòu)，并在基因組里面的固定序列位置進(jìn)行插入，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)轉(zhuǎn)。目前已經(jīng)在CAR-T細(xì)胞治療中得到較多的臨床應(yīng)用，并充分體現(xiàn)出其：低成本、高效率、基因表達(dá)穩(wěn)定的特點(diǎn)。