一、 miRNA高通量測序

隨著高通量測序技術(shù)的普及， miRNA的高通量測序也成為一種常規(guī)技術(shù)。眾所周知miRNA是存在于各個物種中的一種非編碼的小RNA，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)三分之一以上的基因表達，是基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。后來人們又發(fā)現(xiàn)外泌體中的miRNA同樣對生物體具有重要作用，因此掀起了外泌體miRNA研究的熱潮。外泌體是廣泛存在于各種體液中的一種直徑為30-150nm的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的生物活性囊泡，透射電鏡下觀察呈杯狀（圖1），它攜帶了分泌細(xì)胞包含的生物活性物質(zhì)，如DNA、miRNAs、mRNA、長鏈非編碼 RNA（LncRNA）、酶、蛋白質(zhì)和細(xì)胞代謝物等。幾乎所有類型的細(xì)胞都能產(chǎn)生并釋放外泌體，這些外泌體既能在血液等體液內(nèi)傳播，最后又能被其他細(xì)胞吞噬，所以外泌體在細(xì)胞間通信中扮演著十分重要的角色。目前對于外泌體的研究涉及包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移機制、腫瘤診斷標(biāo)志物以及藥物傳遞系統(tǒng)等諸多方面。在外泌體的研究中，miRNA是目前報道最多的成分之一。

上海歐易作為較早提供外泌體miRNA建庫測序服務(wù)的公司之一，在外泌體miRNA建庫方面積累了大量的項目經(jīng)驗，本文將大致介紹我們在外泌體miRNA建庫項目中遇到的一些情況，供老師研究外泌體miRNA參考。

圖1.?透射電鏡下的外泌體

二、 外泌體RNA的量

外泌體的來源有很多，但大致可分為組織樣本、體液樣本和細(xì)胞上清三類。本文不對組織樣本提取外泌體進行討論，只涉及體液和細(xì)胞上清樣本。體液樣本包含了血清血漿、尿液、唾液、乳汁、腦脊液、眼淚、腹水等等。除尿液外，其他體液一般能獲得的體積相對較少。因此抽提得到的RNA量也比較少。在《少量核酸濃度測定的小知識》一文中對這類RNA的定量及其準(zhǔn)確性做過相關(guān)介紹。除體液外，細(xì)胞上清是研究得非常多的樣本，由于獲得難度相對較小，能得到較多的RNA進行后續(xù)實驗。在我們的項目經(jīng)驗中，細(xì)胞上清來源的外泌體抽提得到的總RNA能達到幾十微克甚至更多，但是有的只得到皮克級的總RNA量。這與細(xì)胞上清的體積、細(xì)胞培養(yǎng)方式、細(xì)胞本身分泌外泌體的能力等因素都有關(guān)系。

三、 miRNA文庫條帶與片段分布

1.?正常樣本的miRNA文庫條帶與片段分布

一般正常樣本的miRNA文庫，Bioanalyzer 2100質(zhì)檢時可見文庫峰圖主峰在147nt附近之間（圖2）（147nt-157nt是Illumina 小RNA建庫試劑盒給出的參考值，其它建庫試劑盒的建庫大小參考各家的說明書），對此文庫的測序結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，會發(fā)現(xiàn)文庫片段長度分布圖的主峰在20-24nt之間，大部分動物樣本的最高峰是22nt（圖3）。

圖2?正常樣本miRNA文庫質(zhì)檢峰圖? ??

???圖3?正常miRNA文庫的片段分布

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2.?特殊樣本miRNA文庫條帶與片段分布

用外泌體來源的RNA建庫，經(jīng)常會遇到文庫條帶大小不符合預(yù)期的情況，主峰偏大或偏小都有可能。我們發(fā)現(xiàn)，Bioanalyzer 2100質(zhì)檢的文庫條帶大小往往跟數(shù)據(jù)分析結(jié)果的片段分布有一定的對應(yīng)關(guān)系，例如當(dāng)文庫主峰小于147nt時（圖4），數(shù)據(jù)分析結(jié)果的片段分布一般會出現(xiàn)大量小片段（圖5）。

圖4?外泌體樣本miRNA文庫質(zhì)檢峰圖

??圖5?外泌體miRNA文庫的片段分布

有的樣本miRNA文庫質(zhì)檢時條帶雖然偏?。▓D6），但是測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示小片段偏多的同時，也會含有一些大于30nt的片段（圖7）。當(dāng)然，文庫主峰偏小可能還會出現(xiàn)其它片段分布情況，在此就不一一列舉。另外根據(jù)經(jīng)驗，這種文庫偏小的情況在細(xì)胞上清樣本出現(xiàn)概率相對高一些。

圖6?外泌體樣本miRNA文庫質(zhì)檢峰圖? ?

圖7?外泌體miRNA文庫的片段分布

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文庫質(zhì)檢主峰偏大的情況在外泌體RNA建庫項目中也比較常見。當(dāng)建庫條帶偏大時，數(shù)據(jù)中經(jīng)常出現(xiàn)大量大于30nt的片段，經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)這種分子大部分是tRNA或piRNA。如圖8，圖9所示。

圖8?外泌體樣本miRNA文庫質(zhì)檢峰圖

??圖9?外泌體miRNA文庫的片段分布

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還有的樣本miRNA文庫條帶接近160nt，片段分布結(jié)果顯示有大量的大于35nt的序列存在。外泌體樣本RNA與組織樣本RNA的另一個區(qū)別是組織RNA建small RNA文庫的片段主峰是147nt或偏離147稍微大一些的值，則文庫片段分布很可能是正常的。但是外泌體RNA樣本文庫主峰是偏離147稍微大一些的值，則其片段分布異常的可能性卻比較高。

四、結(jié)論

外泌體來源的RNA樣本建small RNA文庫出現(xiàn)小片段或大片段含量豐富的的概率偏高，而且即使文庫質(zhì)檢的峰值類似，也不代表片段分布會完全一致，這也是我們只能提示實驗有風(fēng)險但卻很難給出準(zhǔn)確風(fēng)險的原因。不過這種片段分布異常的數(shù)據(jù)并非不可用，只能說由于外泌體中的片段成分比較多，文庫結(jié)果依舊能夠相對客觀的反應(yīng)樣本的實際情況。遇到這種情況先不要著急，畢竟雜帶多并不代表目的條帶不在了，目的條帶仍然在，只是含量少，我們需要解決的是如何讓項目數(shù)據(jù)為課題服務(wù)挖掘出有用的信息。在現(xiàn)有技術(shù)水平及具體樣本下，得到有用的結(jié)果才是根本。當(dāng)然，不斷提升實驗技術(shù)水平也是我們非常重要的任務(wù)，讓客戶滿意是每個歐易人的追求。