基因組編輯是一種理想的研究基因功能的方法。它可以精確地識別和定位基因組中的特定序列，然后改變目標(biāo)序列以達到各種目的。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于其簡單的機制已經(jīng)成為當(dāng)今世界基因組編輯的代名詞。其中基因敲除是目前CRISPR/Cas9最常見的應(yīng)用。

在CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除實驗中，Cas9核酸酶在gRNA的指引下，打靶目的基因，并產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂（DSB）。由于DSB的不完全修復(fù)而產(chǎn)生插入和缺失（indels），引起移碼突變，導(dǎo)致終止密碼子提前，實現(xiàn)編碼基因敲除的目的。在CRISPR/Cas9實驗中，gRNA的選擇將很大程度上影響項目的成功率。在選擇gRNA的時候，有幾個因素可以幫助大家選取有效的gRNA以產(chǎn)生成功的敲除：1）預(yù)測gRNA效率；2）選擇脫靶風(fēng)險低的gRNA；3）同時使用多個gRNA以提高敲除效率。在編碼基因敲除實驗中， DNA水平驗證KO結(jié)果是首要的，此外，蛋白質(zhì)水平的驗證也非常關(guān)鍵。蛋白水平的驗證通常是通過Western Blot實現(xiàn)的，但以下這兩種現(xiàn)象，有可能導(dǎo)致截短蛋白仍然表達，從而致使WB驗證時出現(xiàn)陽性情況。

(1)?基因產(chǎn)生移碼突變后，下游ATG密碼子有可能啟動翻譯，從而導(dǎo)致蛋白表達?；蛘呶挥谝拼a突變上游的外顯子翻譯表達，產(chǎn)生N末端截短蛋白。

(2)?細胞跳過被編輯的外顯子翻譯表達，產(chǎn)生內(nèi)部序列缺失的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。

翻譯重新啟動

CRISPR介導(dǎo)的基因敲除通常是通過Cas9產(chǎn)生dsDNA斷裂來實現(xiàn)的：在切割之后，非同源末端連接（NHEJ）的易出錯性質(zhì)會導(dǎo)致在切割位點有一個或多個核苷酸的插入或缺失（indels），從而引起移碼突變，終止密碼子提前，并產(chǎn)生無義介導(dǎo)的降解(NMD)， 從而完全敲除基因。因此打靶位點常常選擇盡量靠近開放閱讀框（ORFs）5′端。然而，這個策略往往會忽略O(shè)RF內(nèi)的存在ATG啟動另一個ORF并翻譯成截短型蛋白的可能。已經(jīng)有不少文章報道過這種非法翻譯（ITL）蛋白，它是與人類疾病相關(guān)的遺傳因素。因此，基因編輯介導(dǎo)的閱讀框外的突變可能會導(dǎo)致非法翻譯，從而表達可被抗體識別的截短型蛋白質(zhì)。

外顯子跳躍

最近，Mu等人報道，利用CRISPR和單個sgRNA，在細胞系中打靶外顯子，可以通過以下兩種機制產(chǎn)生外顯子跳躍：第一種是在突變的前體mRNA剪接過程中發(fā)生的；第二種是由于基因缺失導(dǎo)致多個外顯子和其余外顯子剪接。

已知跳躍多個外顯子的機制是：基因缺失后，完整的外顯子被剪接。更復(fù)雜和令人關(guān)注的是，只有一到幾個核苷酸的突變才會導(dǎo)致前體mRNA剪接過程中外顯子跳躍。除了內(nèi)含子-外顯子邊界的剪接位點外，外顯子還包含對剪接效率起積極或消極作用的序列。外顯子內(nèi)起正作用的元件，稱為外顯子剪接增強子（ESEs），與識別增強剪接機制的因子結(jié)合。起負作用的元件稱為剪接沉默子（ESSs），它被認為是抑制廢置剪接位點的使用。因此，我們可以假設(shè)indel通過破壞ESE或偶然引入ESS來促進外顯子跳躍。這些機制將造成被打靶外顯子缺失的截短型ORF的表達，從而干擾WB驗證結(jié)果及后續(xù)功能實驗。

那我們該怎么做？

對KO實驗進行嚴格的質(zhì)量控制是十分重要的，以確保構(gòu)建的基因敲除細胞不包含隱藏的“驚喜”。理想情況下，我們可以事先預(yù)測如何打靶一個基因來避免外顯子跳過的問題。在設(shè)計KO項目之前，可以做以下實驗，以幫助制定避免上述蛋白殘留的問題的打靶策略。

具有跳躍能力，如果有，則測定蛋白質(zhì)編碼潛能。例如，分別設(shè)計引物，識別位于潛在跳躍外顯子上下游的外顯子，以及目的外顯子，通過比較RT-qPCR結(jié)果，我們將能夠判斷是否發(fā)生了外顯子跳躍，以及它是否會影響基因敲除結(jié)果。

2.?翻譯形式檢測。在抗體特異性很高的前提下，WB結(jié)果中如果出現(xiàn)預(yù)期的條帶，以及在不同分子量（MW）處有其它雜帶，這表明這個基因存在蛋白質(zhì)異構(gòu)體。根據(jù)大小，并結(jié)合上述RT-PCR結(jié)果，可初步判斷編碼異構(gòu)體的ORF。結(jié)合質(zhì)譜分析則可以進一步確認異構(gòu)體的存在及來源ORF的構(gòu)成。

如何設(shè)計有把握的gRNA？

在設(shè)計gRNA時，除了常規(guī)的參數(shù)（靶向效率和脫靶效應(yīng)），應(yīng)根據(jù)數(shù)據(jù)庫、文獻、上述qPCR、WB等檢測結(jié)果來判斷靶基因的潛在的多個轉(zhuǎn)錄本、ORF、起始密碼子位置、外顯子大小和是否不對稱外顯子，來選擇要打靶的位點或區(qū)域。比如，如果存在截短型ORF及非法翻譯，則大靶位點應(yīng)該保證同時會破壞這些ORF；如果存在外顯子跳躍，則應(yīng)該避開靶向被條約的外顯子；如果因為存在多個ORF、外顯子跳躍而無法設(shè)計有效的移碼策略，則應(yīng)該考慮采用大片段敲除或直接破壞啟動子等策略進行敲除。

總之，CRISPR技術(shù)的正確使用始終取決于仔細的實驗設(shè)計、執(zhí)行和分析。為一個實驗選擇gRNA需要平衡最大化打靶效率和最小化脫靶效應(yīng)，同時想獲得無蛋白殘留的KO細胞，則必須在gRNA設(shè)計階段綜合考慮各種因素，確認最優(yōu)方案。

源井生物專注基因編輯細胞技術(shù)服務(wù)，擁有自主研發(fā)的gRNA設(shè)計系統(tǒng)—— “紅棉CRISPR基因編輯系統(tǒng)”，此外專業(yè)的技術(shù)團隊幫助科研工作者設(shè)計完備的基因敲除解決方案。我們已幫助科研一線工作者在100多種細胞系上進行基因編輯。根據(jù)經(jīng)驗積累和數(shù)據(jù)分析，現(xiàn)推出5000個保證WB驗證無誤的基因敲除服務(wù)。