基于UPLC-Q-TOF-MS的淫羊藿化學(xué)成分分析

淫羊藿Epimedii Folium為小檗科植物淫羊藿Epimedium?brevicornu?Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium?sagittatum?(Sieb. et Zucc.) Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium?pubescens?Maxim. 或朝鮮淫羊藿Epimedium?koreanum?Nakai的干燥葉[1]，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用，是最常用的補(bǔ)腎和抗風(fēng)濕藥之一[2]。研究顯示，淫羊藿中含有大量的黃酮類成分，主要為異戊烯基類黃酮，一般認(rèn)為異戊烯基黃酮及其苷類為淫羊藿的主要活性成分，如淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C等[2-5]。中藥所含的化學(xué)成分是其發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，明確淫羊藿藥材中化學(xué)成分對(duì)其臨床療效的保證以及質(zhì)量控制非常重要。

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS）已被廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的快速鑒定、藥物質(zhì)量控制等多個(gè)研究領(lǐng)域[6-7]，可通過(guò)將LC-MS掃描的碎片離子信息和化合物裂解規(guī)律與對(duì)照品或文獻(xiàn)比對(duì)來(lái)快速、準(zhǔn)確地分析中藥中所含化學(xué)成分[8-9]。淫羊藿中不同母核結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分在ESI-MS中有不同的特征碎片，可根據(jù)碎片離子特征和裂解規(guī)律鑒定其所含的化學(xué)成分。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF- MS技術(shù)對(duì)淫羊藿飲片進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)與對(duì)照品或文獻(xiàn)報(bào)道比對(duì)鑒定其中的化學(xué)成分；并通過(guò)10批樣品化學(xué)成分的鑒定結(jié)果，確定其中普遍存在的化學(xué)成分，為闡明淫羊藿藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、提高其質(zhì)量控制水平奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1?儀器與材料

Waters AcquityTM超高效液相系統(tǒng)、Waters XevoTMQTOF MS系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；KDM型電熱套（山東省鄄城縣新華電熱儀器廠）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Sartorious BT25S型十萬(wàn)分之一電子分析天平（賽多利斯公司，德國(guó)）。

色譜純乙腈、甲酸購(gòu)于Acros公司（比利時(shí)）；純凈水為屈臣氏蒸餾水；其他分析純?cè)噭┵?gòu)于天津康科德科技有限公司。對(duì)照品金絲桃苷（批號(hào)PCM-LBM-001）購(gòu)于天津士蘭科技有限公司；朝藿定A（批號(hào)110623-150105）、淫羊藿苷I（批號(hào)56725-141019）和脫水淫羊藿素（批號(hào)38226-141120）購(gòu)于南京春秋生物工程有限公司；淫羊藿苷（批號(hào)MUST-13120510）、朝藿定B（批號(hào)MUST-14062312）、朝藿定C（批號(hào)MUST- 14022312）和寶藿苷I（批號(hào)MUST-14042211）購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司；新綠原酸（批號(hào)140322）和隱綠原酸（批號(hào)140921）購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；各對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。10批淫羊藿飲片均購(gòu)于原產(chǎn)地，其藥材來(lái)源及產(chǎn)地信息見(jiàn)表1，飲片標(biāo)本保存于天津中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)室。

2?方法

2.1?供試品溶液的制備

稱取淫羊藿飲片粗粉10 g，加入100 mL 50%乙醇回流提取1 h，濾過(guò)，濾渣再加入80 mL 50%乙醇回流提取0.5 h，濾過(guò)，合并2次濾液，定容至200 mL，4 ℃保存，備用。進(jìn)樣前用50%乙醇稀釋成生藥質(zhì)量濃度為0.01g/mL的樣品溶液，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2?對(duì)照品溶液的制備

精密稱取金絲桃苷 1.03 mg、淫羊藿苷1.01 mg、朝藿定A 1.01 mg、朝藿定B 1.00 mg、朝藿定C 0.99 mg、寶藿苷I 1.02 mg、淫羊藿苷I 1.01 mg、脫水淫羊藿素 0.98 mg、新綠原酸 1.03 mg和隱綠原酸0.99 mg置于10 mL量瓶中，加入50%乙腈溶解定容至刻度，配制成對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。隨后取1 mL該儲(chǔ)備溶液稀釋定容至10 mL，配制成含金絲桃苷10.3 μg/mL、淫羊藿苷10.1 μg/mL、朝藿定A 10.1 μg/mL、朝藿定B 10.0 μg/mL、朝藿定C 9.9 μg/mL、寶藿苷I 10.2 μg/mL、淫羊藿苷I 10.1 μg/mL、脫水淫羊藿素9.8 μg/mL、新綠原酸 10.3 μg/mL和隱綠原酸9.9 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3?色譜條件

色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm；Waters，美國(guó)）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈溶液，洗脫梯度：0～0.5 min，2% B；0.5～1.5 min，2%～10% B；1.5～3.5 min，10%～20% B；3.5～6.5 min，20%～35% B；6.5～12 min，35%～40% B；12～13 min，40%～50% B；13～15 min，50%～75% B；15～16 min，75%～95%；16～17 min，95% B；體積流量0.4mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5μL。

2.4?質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離源（ESI）在負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，掃描范圍m/z?50～1 000；噴霧電壓3.0 kV，干燥氣體積流量800L/h，溫度350 ℃；霧化氣壓力2 413 kPa；霧化氣為高純氮?dú)?，碰撞氣為高純氬氣，選取 [M－H]??m/z?554.261 5的亮氨酸-腦啡肽進(jìn)行精確質(zhì)量數(shù)校正，數(shù)據(jù)由MassLynx v4.1（Waters Corporation，MA，USA）工作站采集。

2.5?數(shù)據(jù)處理

查閱國(guó)內(nèi)外淫羊藿及其同科屬植物化學(xué)成分研究相關(guān)文獻(xiàn)，收集整理了淫羊藿中化學(xué)成分信息，建立包括化合物中文名、英文名稱、結(jié)構(gòu)式、分子式、精確相對(duì)分子質(zhì)量以及特征碎片的淫羊藿化學(xué)成分文獻(xiàn)信息。通過(guò)與對(duì)照品和整理的化學(xué)成分文獻(xiàn)信息比對(duì)，分析化學(xué)成分的質(zhì)譜信息，從而對(duì)檢測(cè)到的化合物進(jìn)行鑒定。

3?結(jié)果

3.1?化學(xué)成分鑒定

按照“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”和“2.4”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件對(duì)淫羊藿飲片進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS分析，所得樣品的原始基峰離子（BPI）色譜圖見(jiàn)圖1，對(duì)圖中所示的29個(gè)成分進(jìn)行了指認(rèn)。

3.1.1?脫水淫羊藿素母核結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物 淫羊藿中該類黃酮化合物（類型A）B環(huán)的C-4′位由-OCH3取代，糖基取代發(fā)生在C-3位或C-7位[10]。在ESI-MS裂解過(guò)程中主要發(fā)生脫糖基、脫水等中性分子丟失；在負(fù)離子模式下，更容易失去7-位糖基產(chǎn)生基峰離子，而苷元離子較難進(jìn)一步裂解[11]。因此，將苷元離子m/z367作為鑒別該類化合物的特征離子。據(jù)此規(guī)律鑒定出該類化合物23個(gè)，以化合物9為例說(shuō)明鑒定過(guò)程，其他化合物的鑒定結(jié)果如表2所示。

化合物9（tR＝6.18 min）在一級(jí)質(zhì)譜中裂解產(chǎn)生的基峰離子為m/z675，此外還存在明顯的m/z?837離子，在二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生碎片離子m/z?367。可發(fā)現(xiàn)該化合物的質(zhì)譜行為與朝藿定A對(duì)照品一致，故將其鑒定為朝藿定A。推測(cè)化合物9在質(zhì)譜中的裂解過(guò)程：[M－H]?離子m/z837，分子式為C39H50O20，失去1分子葡萄糖形成基峰離子m/z?675 [M－H－glu]?離子，離子m/z?675同時(shí)失去1分子葡萄糖和鼠李糖后產(chǎn)生母核離子m/z?367 [M－H－glu－glu－rha]?，這也與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]，故化合物9確定為朝藿定A。

3.1.2?去甲基脫水淫羊藿素母核結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物 淫羊藿中該類黃酮化合物（類型B）B環(huán)C-4′由-OH取代，該類化合物間的主要差異也是糖基取代的不同，取代方式主要為3-O-、7-O-或3,7-O-雙取代[3,11]。在ESI-MS中主要發(fā)生脫糖基、脫水等中性分子丟失，特征離子為母核離子m/z353離子。據(jù)此規(guī)律，共鑒定出該類化合物6個(gè)，以化合物19為例簡(jiǎn)述鑒定過(guò)程，其他該類化合物的鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

化合物19（tR＝8.21 min）在ESI-MS中裂解主要產(chǎn)生m/z499和m/z?353離子，離子m/z?499.160 8為[M－H]?離子，可能的分子式為C26H28O10，通過(guò)MassLynx v4.1軟件計(jì)算出精確相對(duì)分子質(zhì)量為499.160 4，其精確相對(duì)分子質(zhì)量偏差在5×10?6之內(nèi)，初步推斷該化合物為寶藿苷II（大花淫羊藿苷A），化合物19在二級(jí)質(zhì)譜中給出碎片離子m/z?353，離子m/z353與m/z499相差146，推測(cè)離子m/z?499 [M－H]?失去1分子鼠李糖產(chǎn)生離子m/z353 [M－H－rha]?，根據(jù)文獻(xiàn)給出的精確相對(duì)分子質(zhì)量和裂解過(guò)程，推測(cè)化合物19為寶藿苷II [11,19]。

3.1.3?其他類型的化學(xué)成分 除了上述兩大類異戊烯基取代的黃酮類成分外，淫羊藿中還有簡(jiǎn)單黃酮、有機(jī)酸、木脂素、生物堿等其他成分[19, 23-24]。這些成分的鑒定方法與上述兩類成分相同，即對(duì)照品色譜質(zhì)譜信息和文獻(xiàn)信息進(jìn)行比對(duì)，鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

3.2?不同批次淫羊藿飲片中共有成分分析

按照“2.3”和“2.4”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)一步對(duì)10批淫羊藿飲片進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS分析，檢測(cè)的BPI色譜圖如圖2所示；按照“3.1”項(xiàng)下的方法鑒定10批淫羊藿飲片中的化學(xué)成分，結(jié)果如表3所示。由表3可看出，不同批次淫羊藿飲片的化學(xué)成分存在較大差異，這與飲片的來(lái)源、產(chǎn)地有很大關(guān)系。為了更好地控制飲片質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)確定了10批樣品中的共有成分，分別為木蘭堿、金絲桃苷、epimedoside E、淫羊藿屬苷A、大花淫羊藿苷B、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、icarisoside F、寶藿苷II、箭藿苷A、箭藿苷B、2″-O-rhamnosylikariside II、寶藿苷I、淫羊藿B和脫水淫羊藿素，共16個(gè)成分。確定不同來(lái)源飲片中的共有化學(xué)成分，有利于飲片藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制。

4?討論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)淫羊藿中的化學(xué)成分進(jìn)行快速分析，共鑒定了29個(gè)化合物，其中以脫水淫羊藿素為母核的黃酮類成分17個(gè)、以去甲基脫水淫羊藿素為母核的黃酮類成分6個(gè)、其他化學(xué)成分6個(gè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)淫羊藿飲片中化學(xué)成分的快速分類及鑒定。此外，本實(shí)驗(yàn)還鑒定了10批淫羊藿飲片中的化學(xué)成分，確定了10批樣品中的共有成分16個(gè)，為淫羊藿藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

來(lái) 源：王 媛，袁 磊，李遇伯，張艷軍. 基于UPLC-Q-TOF-MS的淫羊藿化學(xué)成分分析 [J]. 中草藥, 2017, 48(13):2625-2631.

發(fā)布于 2021-12-03 14:58