寫在前面

????????今天推薦的是由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)在2020年1月7日發(fā)表于Cell Reports（2020IF：9.4233，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Zhihua Liu教授，研究表明TTRIM32/USP11平衡了ARID1A的穩(wěn)定性和鱗狀細(xì)胞癌的致癌/抑癌狀態(tài)。

研究背景

????????鱗狀細(xì)胞癌 (SCC) 是一種侵襲性上皮惡性腫瘤，但SCC發(fā)展的分子機(jī)制尚不清楚。ARID1A在各種癌癥類型中經(jīng)常發(fā)生突變，然而ARID1A的突變率和表達(dá)水平在SCC中普遍較低。

摘要部分

????????在這里，作者揭示了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）介導(dǎo)的過(guò)度蛋白質(zhì)降解導(dǎo)致SCC中ARID1A表達(dá)的喪失。作者發(fā)現(xiàn)E3連接酶TRIM32和去泛素化酶USP11在控制ARID1A穩(wěn)定性方面起著關(guān)鍵作用。TRIM32敲低通過(guò)穩(wěn)定ARID1A來(lái)抑制SCC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和化學(xué)抗性，而USP11敲低通過(guò)促進(jìn)ARID1A降解來(lái)促進(jìn)SCC發(fā)展。作者表明，syndecan-2 (SDC2) 是ARID1A和USP11的下游靶標(biāo)，并且SDC2敲低消除了ARID1A缺失導(dǎo)致的致癌功能?？傊?，作者的數(shù)據(jù)揭示了UPS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解是ARID1A缺失的潛在機(jī)制，并提出了TRIM32/USP11-ARID1A-SDC2軸在SCC中的重要作用。

研究?jī)?nèi)容

1.ARID1A主要在C端被UPS修飾

????????為了評(píng)估ARID1A是否在SCC的發(fā)展中起重要作用，作者進(jìn)行了IHC分析以檢測(cè)SCC病例中的ARID1A表達(dá)水平。分析表明，ARID1A表達(dá)水平低的SCC患者預(yù)后較差。為了研究ARID1A是否可以被SCC細(xì)胞中的UPS調(diào)節(jié)，作者用蛋白酶體抑制劑MG132處理了SCC細(xì)胞。MG132處理后ARID1A的蛋白水平顯著升高。qRT-PCR測(cè)定證實(shí)ARID1A的 mRNA 表達(dá)水平在MG132處理后沒(méi)有變化。脈沖追蹤分析表明，ARID1A蛋白在人食管上皮細(xì)胞系NE2和NE3中比在SCC細(xì)胞系中更穩(wěn)定。這些結(jié)果表明，ARID1A穩(wěn)定性由SCC細(xì)胞中的UPS控制。為了確定ARID1A的調(diào)控區(qū)域，作者根據(jù)ARID1A的域構(gòu)建了四個(gè)缺失突變體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A3和A4的表達(dá)水平在MG132處理后明顯積累，表明ARID1A主要受C端UPS的調(diào)控。為了鑒定ARID1A中泛素化修飾的特定賴氨酸位點(diǎn)，F(xiàn)LAG-ARID1A和血凝素-泛素 (HA-Ub) 在293T細(xì)胞中共表達(dá)，并且對(duì)被抗FLAG珠子拉下的免疫沉淀物進(jìn)行質(zhì)譜 (MS) 分析泛素化位點(diǎn)。檢測(cè)到8個(gè)泛素化賴氨酸位點(diǎn)，其中3個(gè)位于A3，2個(gè)分布在A4?？紤]到A3和A4是UPS調(diào)控的主要區(qū)域，作者推測(cè) K1830、K1934、K1961、K2124和 K2243可能是負(fù)責(zé)泛素化的關(guān)鍵位點(diǎn)。為了驗(yàn)證作者的假設(shè)，所有五個(gè)賴氨酸位點(diǎn)都突變?yōu)榫彼?，命名為ARID1A5KR。與作者的推測(cè)一致，突變體ARID1A5KR幾乎失去了被泛素化的能力。為了確定調(diào)節(jié)ARID1A穩(wěn)定性的關(guān)鍵E3連接酶和DUB，使用MS分析評(píng)估了FLAG-ARID1A相關(guān)蛋白，并顯示五個(gè)E3連接酶和四個(gè)DUB與ARID1A相互作用。

研究結(jié)論：RID1A受SCC中UPS的調(diào)控。

?

2.E3連接酶TRIM32與ARID1A相互作用并泛素化以促進(jìn)其降解??? ?

????????作者接下來(lái)選擇了與ARID1A顯著相關(guān)的四種E3連接酶用于進(jìn)一步研究。免疫印跡 (IB) 表明，只有靶向TRIM32的shRNA序列對(duì)增加ARID1A蛋白表達(dá)水平具有穩(wěn)定且顯著的影響，而不影響ARID1A mRNA 表達(dá)水平。作者發(fā)現(xiàn)野生型TRIM32的異位表達(dá)，而不是DR突變體的異位表達(dá)，以劑量依賴性方式降低內(nèi)源性ARID1A蛋白，但不降低mRNA水平。脈沖追蹤分析表明，TRIM32敲低顯著延長(zhǎng)了KYSE30細(xì)胞中ARID1A蛋白的半衰期。相比之下，KYSE410 細(xì)胞中TRIM32的過(guò)表達(dá)加速了ARID1A的降解。

????????為了研究TRIM32在調(diào)節(jié)ARID1A中的作用，作者進(jìn)行了共免疫沉淀 (coIP) 分析，其中將FLAG-ARID1A和Myc-TRIM32共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。在使用抗FLAG磁珠進(jìn)行免疫沉淀 (IP) 后，檢測(cè)到Myc-TRIM32，反之亦然。接下來(lái)，作者繪制了ARID1A與TRIM32相互作用的區(qū)域，結(jié)果顯示A2、A3和A4與這種相互作用有關(guān)。作者進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明只有包含RING結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)TRIM32才能顯著促進(jìn)ARID1A泛素化。泛素化分析表明，當(dāng)K2124突變?yōu)榫彼釙r(shí)，TRIM32對(duì)ARID1A的影響就消失了。因此，TRIM32增加了ARID1A的野生型和4種突變型的不穩(wěn)定性，但不會(huì)增加ARID1A K2124R 的不穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明，TRIM32主要通過(guò)泛素化第2,124位賴氨酸位點(diǎn)來(lái)促進(jìn)ARID1A的降解。

研究結(jié)論：E3連接酶TRIM32與ARID1A相互作用并泛素化以促進(jìn)其降解。

?

3.TRIM32通過(guò)降解ARID1A促進(jìn)SCC增殖和化學(xué)抗性

????????為了研究TRIM32在SCC中的功能，作者首先敲低了KYSE180和NCI-H596細(xì)胞中的TRIM32。CCK-8細(xì)胞活力測(cè)定表明，TRIM32敲低顯著抑制細(xì)胞增殖并增加其對(duì)順鉑 (DDP) 治療的敏感性。為了驗(yàn)證TRIM32敲低的腫瘤抑制功能是由ARID1A表達(dá)增加介導(dǎo)的，作者在表達(dá)靶向TRIM32的shRNA的KYSE30細(xì)胞中敲低了ARID1A。CCK-8和EdU染色測(cè)定均表明ARID1A缺失消除了TRIM32敲低的腫瘤抑制功能。此外，如CCK-8和annxin V/PI雙染色檢測(cè)所檢測(cè)到的，ARID1A缺失回補(bǔ)了TRIM32敲低的KYSE30細(xì)胞對(duì) DDP處理而增加的化學(xué)敏感性。一致地，Transwell 測(cè)定表明TRIM32敲低抑制SCC細(xì)胞遷移和侵襲。接下來(lái)，作者試圖驗(yàn)證TRIM32及其酶活性的致癌功能。野生型或DR突變型不同SSC細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)，只有野生型TRIM32對(duì)降低ARID1A表達(dá)有明顯影響。因此，CCK-8 細(xì)胞活力和Transwell測(cè)定表明野生型TRIM32促進(jìn)SCC細(xì)胞增殖、化學(xué)抗性、遷移和侵襲，而DR突變體TRIM32沒(méi)有顯示出明顯的致癌功能。為了證實(shí)TRIM32在體內(nèi)的致癌功能，使用表達(dá)靶向TRIM32的shRNA的KYSE30和KYSE410細(xì)胞進(jìn)行異種移植實(shí)驗(yàn)。TRIM32敲低不僅顯著抑制了鹽水治療組的腫瘤生長(zhǎng)，而且還增加了腫瘤對(duì)DDP的敏感性。ARID1A的進(jìn)一步敲低恢復(fù)了由TRIM32損失引起的影響。然而，升高的TRIM32水平顯著促進(jìn)了體內(nèi)KYSE410細(xì)胞的生長(zhǎng)和化學(xué)抗性，并且ARID1A的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這種效果。

研究結(jié)論：TRIM32的過(guò)表達(dá)通過(guò)下調(diào)ARID1A蛋白表達(dá)加速SCC的進(jìn)展。

?

4.USP11與ARID1A相互作用并使其去泛素化

????????MS分析表明ARID1A和USP11或USP39之間存在特異性相互作用或。作者用shRNA序列敲低了KYSE30細(xì)胞中USP11或USP39的表達(dá)，IB結(jié)果顯示，USP11敲低后，ARID1A表達(dá)顯著降低，但USP39敲低未顯示ARID1A的明顯下調(diào)。脈沖追蹤分析還表明，USP11而非USP11 C318A（無(wú)酶活突變體）的過(guò)表達(dá)顯著延長(zhǎng)了KYSE30細(xì)胞中內(nèi)源性ARID1A的半衰期。一致地，表達(dá)靶向USP11的 shRNA的KYSE410細(xì)胞中的ARID1A蛋白比表達(dá)對(duì)照shRNA的細(xì)胞中的蛋白明顯更不穩(wěn)定。接下來(lái)，作者試圖探索USP11是否充當(dāng)ARID1A的真正去泛素化酶。coIP 分析表明ARID1A和USP11可以直接相互結(jié)合。作者隨后進(jìn)行了泛素化分析以驗(yàn)證USP11對(duì)ARID1A的酶促調(diào)節(jié)。結(jié)果表明，野生型USP11可以顯著去除ARID1A上修飾的泛素鏈，但USP11 C318A失去了這種能力。為了確定ARID1A上去泛素化事件的位點(diǎn)，作者分別將 K1830、K1934和 K1961突變?yōu)榫彼?。泛素化分析顯示ARID1A K1961R不能被USP11去泛素化，說(shuō)明第1,961個(gè)賴氨酸位點(diǎn)負(fù)責(zé)這種去泛素化。脈沖追蹤分析也證實(shí)K1961是介導(dǎo)USP11在ARID1A上穩(wěn)定的重要位點(diǎn)。

研究結(jié)論：USP11與ARID1A相互作用并使其去泛素化。

?

5.USP11通過(guò)穩(wěn)定ARID1A防止SCC增殖和轉(zhuǎn)移

????????為了驗(yàn)證USP11在SCC中的作用，作者在NCI-H596細(xì)胞中過(guò)表達(dá)野生型和突變型USP11，發(fā)現(xiàn)野生型USP11的過(guò)表達(dá)顯著增加了ARID1A蛋白水平。CCK-8細(xì)胞活力測(cè)定顯示野生型USP11的過(guò)表達(dá)顯著抑制 NCI-H596細(xì)胞的增殖。野生型USP11的過(guò)表達(dá)也增加了NCI-H596細(xì)胞對(duì)DDP處理的敏感性，而突變型USP11的過(guò)表達(dá)則沒(méi)有這種影響。因此，Transwell和傷口愈合試驗(yàn)表明野生型USP11可以抑制NCI-H596細(xì)胞遷移和侵襲。為了驗(yàn)證USP11的腫瘤抑制功能依賴于ARID1A，作者敲低了USP11過(guò)表達(dá)KYSE30細(xì)胞中的ARID1A，結(jié)果顯示ARID1A缺失消除了USP11在KYSE30細(xì)胞中的腫瘤抑制功能。體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)還表明USP11抑制SCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并且可以通過(guò)ARID1A敲低來(lái)回補(bǔ)。接下來(lái)，作者在KYSE410和YES2細(xì)胞中敲低USP11，然后過(guò)表達(dá)ARID1A。USP11敲低顯著促進(jìn)SCC細(xì)胞的增殖、化學(xué)抗性、遷移和侵襲，而ARID1A異位表達(dá)減少了USP11耗竭引起的致癌作用。

研究結(jié)論：USP11敲低通過(guò)促進(jìn)ARID1A降解來(lái)促進(jìn)SCC進(jìn)展，即USP11通過(guò)穩(wěn)定ARID1A抑制SCC的發(fā)展。

?

6.核TRIM32和USP11表達(dá)與SCC細(xì)胞系和患者樣本中的ARID1A表達(dá)相關(guān)

????????之前研究表明TRIM32和USP11對(duì)ARID1A蛋白質(zhì)穩(wěn)定性具有強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，作者接下來(lái)試圖驗(yàn)證這三種蛋白質(zhì)在SCC細(xì)胞和樣品中表達(dá)的相關(guān)性。TRIM32和USP11均在SCC細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，但其底物ARID1A僅在細(xì)胞核中表達(dá)和發(fā)揮功能；因此，作者檢查了三種蛋白的核表達(dá)水平。IB結(jié)果顯示核TRIM32表達(dá)水平與ARID1A蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，而核USP11表達(dá)水平與ARID1A表達(dá)水平呈正相關(guān)。IHC分析還顯示，核ARID1A和TRIM32之間以及ARID1A和USP11之間分別存在顯著的負(fù)相關(guān)和正相關(guān)。進(jìn)一步的分析表明，TRIM32的高表達(dá)水平與不良預(yù)后、轉(zhuǎn)移和晚期病理分期相關(guān)，表明它是SCC中的關(guān)鍵癌基因，并有可能成為治療靶點(diǎn)。相比之下，高USP11表達(dá)水平與良好的預(yù)后相關(guān)，盡管它與其他臨床變量沒(méi)有顯著相關(guān)性。

研究結(jié)論：TRIM32和USP11與SCC中的ARID1A表達(dá)相關(guān)。

?

7.ARID1A不穩(wěn)定性激活SDC2和致癌信號(hào)

????????為了研究由TRIM32過(guò)表達(dá)或USP11敲低引起的ARID1A不穩(wěn)定性如何促進(jìn)SCC發(fā)展的潛在機(jī)制，作者進(jìn)行了RNA測(cè)序（RNA-seq）測(cè)定。有33個(gè)基因在ARID1A敲低和USP11敲低細(xì)胞中顯著上調(diào)。數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析表明，細(xì)胞粘附分子 (CAM) 構(gòu)成了ARID1A或USP11敲低后顯著上調(diào)基因或33個(gè)重疊基因的最高富集基因組之一。在重疊基因中，作者專注于SDC2，一種跨膜（I 型）硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。已在多種癌癥類型中檢測(cè)到SDC2表達(dá)的改變，SDC2被認(rèn)為是SCC的診斷標(biāo)志物。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ARID1A敲低時(shí)SDC2的激活和ARID1A過(guò)度表達(dá)時(shí)SDC2的抑制。作者接下來(lái)進(jìn)行了ChIP分析以研究ARID1A對(duì)SDC2的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果表明，ARID1A敲低導(dǎo)致ARID1A與SDC2啟動(dòng)子區(qū)域之間的分離，并導(dǎo)致Rbp1與SDC2啟動(dòng)子區(qū)域之間的關(guān)聯(lián)增強(qiáng)。此外，在ARID1A敲低后，Brg1和SDC2啟動(dòng)子區(qū)域之間的關(guān)聯(lián)降低。表明ARID1A缺失通過(guò)染色質(zhì)重塑介導(dǎo)的基因激活在轉(zhuǎn)錄水平激活SDC2表達(dá)。IB還顯示USP11和ARID1A過(guò)表達(dá)均抑制SDC2表達(dá)，以減少通過(guò)PI3K/Akt、MAPK和 Wnt等通路的致癌信號(hào)傳導(dǎo)。作者還發(fā)現(xiàn)SDC2的敲低削弱了ARID1A/USP11敲低或TRIM32過(guò)表達(dá)引起的增殖、化療抵抗、遷移和入侵的增加。據(jù)報(bào)道，SDC2選擇性地結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (FGF) 和表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)；因此，作者接下來(lái)研究了這些細(xì)胞因子是否可以激活SDC2介導(dǎo)的致癌信號(hào)。作者處理了表達(dá)異位ARID1A、USP11或靶向TRIM32的 shRNA的KYSE30細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子可以通過(guò)USP11過(guò)表達(dá)或TRIM32敲低來(lái)消除ARID1A表達(dá)升高的抑制功能。此外，VEGF、FGF和EGF處理重新激活了由ARID1A或USP11過(guò)表達(dá)引起的抑制致癌信號(hào)。

研究結(jié)論：ARID1A不穩(wěn)定性激活SDC2和致癌信號(hào)。

?

8.TRIM32/USP11平衡ARID1A穩(wěn)定性并影響SCC的干性、腫瘤發(fā)生和化學(xué)抗性

????????為了研究由TRIM32/USP11控制的ARID1A穩(wěn)定性平衡的SCC細(xì)胞的致癌/腫瘤抑制狀態(tài)，作者在KYSE180細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TRIM32、USP11或ARID1A以評(píng)估它們的功能。TRIM32的過(guò)表達(dá)降低了 KYSE180 細(xì)胞中ARID1A的表達(dá)水平，而USP11的過(guò)表達(dá)增加了ARID1A蛋白的表達(dá)水平。IB分析顯示TRIM32過(guò)表達(dá)促進(jìn)SDC2表達(dá)和Akt、Erk1/2和 LRP6的磷酸化，表明致癌信號(hào)被激活。相比之下，USP11和ARID1A的過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制SDC2來(lái)抑制這些途徑。作者接下來(lái)進(jìn)行了IB以檢測(cè)表達(dá)TRIM32、USP11或ARID1A的 KYSE180 細(xì)胞中的幾種干細(xì)胞和分化標(biāo)志物。TRIM32過(guò)表達(dá)顯著增加了干性標(biāo)志物 SOX2和NANOG的表達(dá)水平，并降低了分化標(biāo)志物角蛋白4和角蛋白13。然而，USP11和ARID1A的過(guò)表達(dá)降低了干性標(biāo)記的表達(dá)并增加了分化標(biāo)記的表達(dá)。一致地，TRIM32過(guò)表達(dá)阻止了細(xì)胞凋亡，而USP11和ARID1A過(guò)表達(dá)促進(jìn)了KYSE180細(xì)胞對(duì)DDP處理的敏感性，TUNEL和IB分析表明?？寺⌒纬稍囼?yàn)和球體形成試驗(yàn)表明也是同樣的趨勢(shì)。然而，USP11或ARID1A的過(guò)表達(dá)降低了細(xì)胞的集落形成和球體形成能力。為了評(píng)估TRIM32/USP11控制的ARID1A在腫瘤起始中的作用，作者進(jìn)行了體內(nèi)腫瘤形成試驗(yàn)，其中表達(dá)異位TRIM32、USP11或ARID1A的KYSE180細(xì)胞數(shù)量增加被異種移植到NCG小鼠中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIM32促進(jìn)腫瘤形成，而USP11/ARID1A在體內(nèi)抑制KYSE180細(xì)胞的腫瘤形成能力。

研究結(jié)論：TRIM32和USP11控制ARID1A穩(wěn)定性以維持SCC細(xì)胞的致癌/腫瘤抑制狀態(tài)。

?

結(jié)論與討論

????????使用RNA-seq分析，作者發(fā)現(xiàn)SDC2是ARID1A缺失后的下游目標(biāo)。機(jī)制研究表明,ARID1A缺失通過(guò)染色質(zhì)重塑轉(zhuǎn)錄激活SDC2，其中SWISNF復(fù)合物中的結(jié)構(gòu)變化使SDC2的轉(zhuǎn)錄激活增強(qiáng)。作者發(fā)現(xiàn)SDC2激活致癌信號(hào)，如PI3K/Akt、Ras/MAPK和Wnt/LRP6信號(hào)通路，以促進(jìn)SCC的發(fā)生和進(jìn)展。作者的研究結(jié)果表明, TRIM32/USP11-ARID1A-SDC2軸對(duì)SCCs的進(jìn)展至關(guān)重要這一發(fā)現(xiàn)為靶向TRIM32或SDC2治療ARID1A表達(dá)水平低的SCc病例提供了一個(gè)潛在的策略。

Thank you!

?

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.12.017