基本信息

細(xì)胞名稱：人原代NK細(xì)胞

組織來源：骨髓

細(xì)胞形態(tài)：大顆粒淋巴細(xì)胞

生長特性：懸浮生長

支原體：無

背景簡介：NK細(xì)胞又稱自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)，NK細(xì)胞形態(tài)上屬于大顆粒淋巴細(xì)胞，來源于骨髓，是除T細(xì)胞、B細(xì)胞之外的第三大類淋巴細(xì)胞，約占血液中所有免疫細(xì)胞（白細(xì)胞數(shù)量）的15%，屬于天然免疫系統(tǒng)的核心細(xì)胞。

NK細(xì)胞存在于大多數(shù)器官（骨髓、肺、淋巴結(jié)、外周血、脾臟和肝臟）。NK細(xì)胞也被描述在許多其他器官中，如腸、皮膚、膀胱、扁桃體、子宮、胸腺、腎臟、胰腺、脂肪組織，甚至在小鼠大腦中。

細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞特點(diǎn)

1.?免疫監(jiān)視

NK免疫細(xì)胞能高度識別、監(jiān)視體內(nèi)細(xì)胞病變，防止超敏反應(yīng)，執(zhí)行免疫監(jiān)視。

2.?清除病原體

防止鄰近的神經(jīng)元相互干擾，且參與形成血—腦屏障，對物質(zhì)的運(yùn)輸有一定選擇作用。

3.?抗衰老

免疫細(xì)胞可誘導(dǎo)老細(xì)胞凋亡，促進(jìn)信息報產(chǎn)生，提升精力、體力、延緩衰老。

4.?殺傷腫瘤細(xì)胞

NK 細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，可靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞，是未來治療腫瘤的體細(xì)胞。

實(shí)驗介紹

本實(shí)驗室采用獨(dú)有的細(xì)胞因子培養(yǎng)法，將外周血中的單個核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。經(jīng)過14天的誘導(dǎo)培養(yǎng)CD3-/CD56+NK細(xì)胞絕對數(shù)量可擴(kuò)增達(dá)到1000倍，其純度可達(dá)80%以上

材料準(zhǔn)備

儀器：離心機(jī)、顯微鏡、計數(shù)器、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱。

試劑：人外周血淋巴細(xì)胞分離液、清洗液、NK細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E。

耗材：10 mL移液管、15 mL離心管、采血管、T75培養(yǎng)瓶、T175培養(yǎng)瓶。

操作步驟

提前開啟紫外線照射超鏡臺30分鐘，超鏡臺通風(fēng)10分鐘以上，水浴鍋提前開啟加熱至56℃，提前準(zhǔn)備好移液管、T75培養(yǎng)瓶、人外周血淋巴細(xì)胞分離液、清洗液、NK細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、因子、1 mL槍頭、200 μL槍頭、移液槍、15 mL離心管，提前從冰箱取出放置室溫。

（一）單個核細(xì)胞分離

血液樣本量為10 mL，取兩支15 mL離心管各加入5 mL分離(液與血液體積相同)用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500轉(zhuǎn)離心20分鐘（分離PBMC時離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為慢升慢降，升為9，降調(diào)為0）離心后，此時離心管中由上至下分為4層，第一層為血漿層，第二層為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層，第三層為透明分離液層，第四層為紅細(xì)胞層。收集血漿到新的離心管中血漿56℃30分鐘滅活900轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清置于4℃保存，用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個和細(xì)胞層到另一個50 mL離心管中，向所得離心管中加入10 mL清洗液混勻細(xì)胞，300轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清用吸管以10 mL清洗液重懸所得細(xì)胞300轉(zhuǎn)離心10分鐘，之后重復(fù)進(jìn)行清洗步驟。棄上清后以0.5 mL后續(xù)實(shí)驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

（二）NK細(xì)胞培養(yǎng)

D0天：約用10 mL NK基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加入因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自體血漿將制備好的單個核細(xì)胞（PBMC）重懸，按細(xì)胞密度1.0-2.0M cells/mL鋪于T-75瓶中搖晃混勻后做好標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

D4天：補(bǔ)加10 mL培養(yǎng)基（含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自體血漿）此時瓶子含20 mL培養(yǎng)基做好標(biāo)記后放,入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

D6天：補(bǔ)加20毫升培養(yǎng)基（含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自體血漿）此時瓶里含有40 mL培養(yǎng)基做好標(biāo)記后,放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

D8天：往培養(yǎng)瓶補(bǔ)加40 mL培養(yǎng)基（含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和1%自體血漿）同時加入因子NK-E將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至T175瓶中，此時瓶子含80mL培養(yǎng)液做好標(biāo)記后，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

D10天：往培養(yǎng)瓶補(bǔ)加80 mL培養(yǎng)基（含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E和1%自體血漿）此時瓶子含160 mL培養(yǎng)液做好標(biāo)記后，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

D12天：往培養(yǎng)瓶補(bǔ)加160 mL培養(yǎng)基（含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E和1%自體血漿）此時瓶子含320 mL培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液分至另一個培養(yǎng)瓶中做好標(biāo)記后，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

D14天到15天:收獲目的細(xì)胞

NK細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

采血環(huán)節(jié)注意事項

1. 因為EDTA會影響免疫細(xì)胞的激活與擴(kuò)增，采集血樣時禁止使用 EDTA 抗凝的真空采樣管。

2. 采血管選擇：肝素鈉采血管>枸櫞酸鈉采血管

3. 暫存：4度

血漿

1. 自體血漿滅活前可以加入8%葡萄糖酸鈣注射液，減少血漿凝固、血漿添加后細(xì)胞出絮等問題。

2. 滅活后的自體血漿在4℃冰箱保存即可，請在一個培養(yǎng)周期內(nèi)使用完畢。

3. 培養(yǎng)中后期自體血漿不足時，可以選用AB血漿

4. 不建議使用人血清白蛋白替代，其中營養(yǎng)物質(zhì)較少，效果較差

血小板、紅細(xì)胞混入問題

1. 部分外周血在提取PBMC的過程中，白膜層可能會存在一些紅細(xì)胞，吸取時應(yīng)盡可能避開有紅細(xì)胞部分。

2. 若不易區(qū)分，則接種PBMC應(yīng)稍加大接種量。

3. 不建議加入紅細(xì)胞裂解液等，對免疫細(xì)胞的活性、增殖能力存在較大影響。

培養(yǎng)基配制及補(bǔ)液

1. 每次補(bǔ)液時添加的培養(yǎng)基需預(yù)溫，用多少取多少，禁止將整瓶培養(yǎng)基預(yù)溫、禁止反復(fù)預(yù)溫。

2. 培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，配成完全培養(yǎng)基后4°保存。

培養(yǎng)期間需注意

1. 使用經(jīng)過TC處理的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

2. 盡可能使用大體積的培養(yǎng)袋，促進(jìn)細(xì)胞間的氣體交換，防止代謝廢物過多影響細(xì)胞增殖。

3. 如采用1L培養(yǎng)體系，推薦使用2L培養(yǎng)袋；采用2L培養(yǎng)體系，推薦每個1L體系使用1.8L培養(yǎng)袋。

4. 剛?cè)氪鼤r，一般細(xì)胞培養(yǎng)袋大而細(xì)胞液體積小，建議將培養(yǎng)袋對折使用（d7），選擇合適的底面積培養(yǎng)。

5. 接種密度：外周血的推薦接種密度為1.5-2E6cells/mL；

避免細(xì)胞機(jī)械損傷

1. 細(xì)胞接種后，第1-3天會形成懸浮細(xì)胞小團(tuán)，第3-5天絕大部分懸浮細(xì)胞團(tuán)貼壁，不可將其晃起，第5-7天貼壁的細(xì)胞團(tuán)變大、變多，這些都是正常的細(xì)胞形態(tài)。

2. 培養(yǎng)前期一定不要吹打細(xì)胞團(tuán)（D0-D5），以減少細(xì)胞機(jī)械損傷。

NK細(xì)胞鑒定

NK細(xì)胞培養(yǎng)常見問題解答

1.問：NK細(xì)胞成團(tuán)分布，如果不吹打細(xì)胞團(tuán)，會引起細(xì)胞老化嗎？

1.答：NK細(xì)胞成團(tuán)分布是一種非常正常的細(xì)胞形態(tài)，不吹打不會引起細(xì)胞老化。如果細(xì)胞團(tuán)過大，可以在鏡下觀察，如果細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部呈現(xiàn)一種透亮的狀態(tài)，說明團(tuán)塊內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)很充足。如果團(tuán)塊呈現(xiàn)出漆黑的狀態(tài)，此時可以適當(dāng)考慮把細(xì)胞團(tuán)塊吹散。

2.問：分離單個核細(xì)胞時，紅細(xì)胞摻雜比較多，怎么改善？

2.答：分離時有時會存在紅細(xì)胞摻雜比較多的問題，紅細(xì)胞會在5～7天時皺縮凋亡，但是它會影響單個核細(xì)胞的計數(shù)。

? ? ? ? ?一般有兩個處理方案：（1）對樣本下層紅色液體，按照1:2的比例采用緩沖液進(jìn)行稀釋；（2）取少部分細(xì)胞懸液，做紅細(xì)胞裂解，從而達(dá)到對單個核細(xì)胞精確計數(shù)的目的。

3.問：PBMC里的NK細(xì)胞凍存復(fù)蘇后為還能繼續(xù)擴(kuò)增嗎？

3.答：免疫類細(xì)胞的復(fù)蘇靜默期較長，一次凍存對于細(xì)胞質(zhì)量的影響非常大。培養(yǎng)完成的NK量非常大，經(jīng)過凍存后較難恢復(fù)到新鮮效果，成體NK細(xì)胞一般是直接用于臨床。

4.問：換瓶或轉(zhuǎn)袋時，舊培養(yǎng)瓶中殘留細(xì)胞如何處理？

4.答：當(dāng)培養(yǎng)體積不斷擴(kuò)大后，需要進(jìn)行換瓶或轉(zhuǎn)袋處理。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新容器后，原培養(yǎng)瓶在顯微鏡下觀察通常能看到瓶壁上仍附有較多細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)，可在原培養(yǎng)瓶中添加適當(dāng)新鮮培養(yǎng)基（無需添加血漿），繼續(xù)培養(yǎng)1-2天后可觀察到大量細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)已懸浮在培養(yǎng)液中，此時可將這些細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移合并回到正常體系培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋中。舊培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1-2天后仍無法脫落的細(xì)胞直接丟棄。

NK細(xì)胞的應(yīng)用

預(yù)防腫瘤

1. NK細(xì)胞的活力和功效隨著年齡的增長逐漸降低

2.?隨著年齡的增長，人體免疫力逐漸減弱，腫瘤發(fā)病率逐年提高。

3. NK細(xì)胞是免疫細(xì)胞的一種，被醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為“抗癌第一道防線”

4. NK細(xì)胞可以通過釋放穿孔素、顆粒酶、抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常的細(xì)胞沒有任何傷害。

抗衰老

1. NK免疫細(xì)胞不僅可以清除癌變、病變細(xì)胞，還具有清除衰老細(xì)胞、病毒和自由基的功效。

2. NK細(xì)胞能夠提升人體免疫力，抵抗衰老，改善睡眠，全面改善新陳代謝功能。

預(yù)防乙肝病毒

NK細(xì)胞治療可以直接清除HBV,還可以清除被病毒感染的肝細(xì)胞。通過定期回輸激活后的NK免疫細(xì)胞，進(jìn)行NK細(xì)胞抗病毒，可以預(yù)防病毒性肝炎進(jìn)一步惡化成肝硬化和肝癌。

保護(hù)呼吸系統(tǒng)

NK免疫細(xì)胞能顯著減輕肺部的炎性反應(yīng)，清除肺部病變的細(xì)胞，為根本性預(yù)防肺部疾病帶來了希望。

預(yù)防生殖系統(tǒng)炎癥

NK免疫細(xì)胞在修復(fù)全身各器官衰老的同時，能顯著地修復(fù)生殖系統(tǒng)的衰老退化，恢復(fù)和加強(qiáng)男性和女性性功能。

恢復(fù)皮膚彈性，再現(xiàn)青春容顏

NK細(xì)胞通過清理衰老細(xì)胞、促進(jìn)新陳代謝，具有顯著的美容美膚和美發(fā)效果。NK細(xì)胞能使松弛下垂的皮膚光滑收緊，恢復(fù)皮膚彈性，減少皮膚皺紋和色素沉著。

NK細(xì)胞療法臨床試驗

據(jù)統(tǒng)計，全球 NK 相關(guān)的細(xì)胞療法臨床試驗數(shù)量達(dá) 283 個

逸漠推薦產(chǎn)品

產(chǎn)品優(yōu)勢

穩(wěn)定性：培養(yǎng)14天 可獲得1000倍以上細(xì)胞擴(kuò)增，CD3-/CD56+NK比例達(dá)到80%以上。

通用性：新鮮樣本與凍存樣本均可培養(yǎng)，僅需10-30ml血樣即可上樣培養(yǎng)。

程序化：培養(yǎng)方式簡單易行，細(xì)胞狀態(tài)基本統(tǒng)一，按照推薦流程補(bǔ)液，無需進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。