慢性腎盂腎炎動(dòng)物模型【疾病動(dòng)物模型】

【造模機(jī)制】大腸桿菌由膀胱不完全梗阻輸尿管逆行感染,早期可致單側(cè)急性腎盂腎炎病變。晚期可致慢性腎盂腎炎病變,患側(cè)腎臟變性萎縮、機(jī)體細(xì)胞免疫功能紊亂,抑制性 T細(xì)胞(Ts)功能低下,免疫球蛋白(IgA.IgM)增加,免疫活性細(xì)胞浸潤(rùn),導(dǎo)致免疫病理?yè)p傷,造成腎組織結(jié)構(gòu)的溶解,最終腎臟完全萎縮。

【造模方法】

1.動(dòng)物和器材試劑選用 C57BL/6J 雄性小鼠,體重 18～20g,隨機(jī)分組。大腸桿菌0m ：B：H,引自中國(guó)菌種保護(hù)中心；培養(yǎng)基:肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂和半固體培養(yǎng)基。試劑:腸桿菌微量快速鑒定法,致病性大腸桿菌 O.iiB 診斷血清。羊抗鼠 IgG 血清和羊抗兔 IgG 酶標(biāo)抗體,兔抗羊 IgG 酶標(biāo)抗體。

2.模型制備造模前制備菌液,并對(duì)大腸桿菌進(jìn)行鑒定,在接種動(dòng)物前,將細(xì)菌接種于一只小鼠腎臟,24 小時(shí)取患腎細(xì)菌,將該增毒后的細(xì)菌溶于無菌鹽水中,用比濁法調(diào)菌液濃度為(2~6)×10°/ml,立即接種模型動(dòng)物。模型制作:小鼠術(shù)前禁水 24 小時(shí),常規(guī)消毒,于下腹部正中切口 1.0cm。暴露右側(cè)輸尿管,用縫合線將其拉向右側(cè),并固定于腹壁外;擠出膀胱內(nèi)殘尿,向膀胱內(nèi)注人大腸桿菌懸液約 0.2ml,縫合腹部切口,24 小時(shí)后拆去右側(cè)腹壁外輸尿管的固定線,正常清潔及飼養(yǎng)。單純梗阻組:按實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头椒ㄊ中g(shù),但膀胱內(nèi)不注射菌液,以等量生理鹽水代替。

3.樣本采集和指標(biāo)測(cè)定取樣時(shí)間:實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物分別在術(shù)后 6 小時(shí),12 小時(shí),24小時(shí),48 小時(shí),3 天.5 天.7 天、15 天,30 天,60 天,90 天、120 天、150天處死;單純梗阻組動(dòng)物分別術(shù)后 1 天、3 天.5 天處死。各組每階段分別處死 7 只動(dòng)物。

觀察指標(biāo)：(1）腎臟重量:稱量雙腎重量,以其所占自身體重的干分比表示其重量。

(2）細(xì)菌培養(yǎng):尿及心臟血液定性培養(yǎng)。雙腎按1g 腎重量相當(dāng)于 1ml鹽水體積計(jì)算，補(bǔ)加鹽水至 1ml,制成勾漿,系列稀釋定量培養(yǎng),以每毫克腎組織所占的細(xì)菌數(shù)(個(gè)/mg),表示腎臟菌量。

(3)血清檢測(cè):血清 1gG:用單向擴(kuò)散法,將羊抗鼠 1gG制成瘀脂擴(kuò)散板,打孔向孔中加人血清,以擴(kuò)散環(huán)直徑表示血清 IgG 相對(duì)含量。

(4）血清大腸桿菌凝集效價(jià)測(cè)定:將大腸桿菌 OmB 溶于 5%甲醛中,用比濁法使其濃度為10*/ml,將血清倍比稀釋,玻片凝集,以凝集的最大稀釋倍數(shù)表示血清抗大腸桿菌凝集效價(jià)。

（5）腎臟形態(tài)觀察:取部分腎組織,立即固定于 10%中性甲醛中 24 小時(shí)以上,常規(guī)石蠟切片,HE 染色。動(dòng)物處死后立即取下腎臟,并速凍于液氮中,經(jīng)冷凍切片后用丙酮固定,然后用羊抗鼠 IgG 抗大腸桿菌抗血清,進(jìn)行 DAB 染色等免疫組化方法,檢測(cè) IgG 沉積及菌體抗原存在。

【模型特點(diǎn)】

1.可觀察從急性感染到慢性萎縮,整個(gè)腎盂腎炎發(fā)展的全過程這是最突出的特點(diǎn),尿細(xì)菌培養(yǎng) 6 小時(shí)起即為陽(yáng)性,一直持續(xù)到 30 天,患腎感染 2 天內(nèi)腎孟黏膜就出現(xiàn)廣泛性化膿灶,髓質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)不同程度中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),并有化膿灶形成,7 天后腎病變面積更加廣泛并出現(xiàn)化膿灶和壞死灶,30 天轉(zhuǎn)為慢性炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn),60 天轉(zhuǎn)為局灶性,90 天后患腎極度萎縮,腎組織破壞嚴(yán)重,免疫組化染色觀察 30 天菌體抗原 IgG 有沉積,至 90 天仍有 1gG 沉積。

2.單側(cè)患病,便于對(duì)照健患側(cè)處在同一動(dòng)物體內(nèi),感染機(jī)會(huì),變化程度,腎臟重量等形成良好的自身對(duì)照。健腎始終未受病變累及,未見 IgG 沉積,說明本模型無自身免疫因素的參與,這是自身健患對(duì)照說明的重要理論問題。而且健腎又可代償,可進(jìn)行長(zhǎng)期觀察。

3.與人類相似,代表性強(qiáng)人類腎盂腎炎大多為大腸桿菌逆行感染,病變多為單側(cè)或一輕一重,且形成慢性腎盂腎炎,多有梗阻,反流等因素存在。

4.全面系統(tǒng),動(dòng)態(tài)觀察由于小鼠能長(zhǎng)期存活,便于動(dòng)態(tài)觀察,能夠獲得每個(gè)階段的血清學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)菌學(xué)、病理學(xué)等多學(xué)科材料,為慢性腎盂腎炎的基礎(chǔ)研究及防治提供了良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

【應(yīng)用范圍】研究慢性腎盂腎炎的發(fā)病機(jī)制,特別是與機(jī)體免疫功能的關(guān)系,研究慢性腎盂腎炎的病理變化及病變機(jī)制。還適用于中藥治療方法和藥效學(xué)研究。

【注意事項(xiàng)】

1.術(shù)前禁水術(shù)前禁水,尿液濃縮,加之術(shù)中失血,失水,使動(dòng)物處于脫水狀態(tài),輸尿管無尿液下排,膀胱內(nèi)的細(xì)菌很快經(jīng)輸尿管逆行感染到腎臟,致使在 6 小時(shí)后雙腎均有細(xì)菌檢出。

2.不全梗阻將 BrooRS 的方法加以改良,形成單側(cè)輸尿管暫時(shí)不全梗阻,使腎盂腔內(nèi)的細(xì)菌進(jìn)人腎實(shí)質(zhì)而形成炎癥。健腎無梗阻損害,早期感染的細(xì)菌隨腎臟恢復(fù)排尿而被排出,腎內(nèi)未形成明顯的感染病灶。3.接種菌量菌液濃度為(2~6)×10*/ml較合適,濃度低不易感染或感染率低,濃度過高易形成菌血癥。另外,尚與細(xì)菌的毒力有關(guān),應(yīng)先經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)繁殖 24 小時(shí),增毒后使用。

【模型評(píng)估】腎盂腎炎是泌尿系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病,慢性腎盂腎炎由于病程長(zhǎng),反復(fù)發(fā)作,防治難度大,多預(yù)后不良。單側(cè)逆行性大腸桿菌感染的慢性腎盂腎炎模型,從致病菌、感染途徑,病理和免疫改變等方面均與人類慢性腎盂腎炎相似,造模方法簡(jiǎn)單,感染率高,病變顯著且均一,重復(fù)性好,是研究人類腎盂腎炎的理想動(dòng)物模型。

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