1.HT-29細胞的背景

HT-29細胞系是在1964年由Fogh 和 Trempe 兩位科學(xué)家分離發(fā)現(xiàn)，來源于一名患結(jié)直腸癌(CRC)的白人女性的原發(fā)腫瘤。 HT-29細胞具備成熟腸細胞的特征，當(dāng)給予不同的培養(yǎng)條件或者誘導(dǎo)劑時，它會表現(xiàn)出不同的分化途徑，因此HT-29細胞可作為研究腸道細胞分化分子機制的獨特模型。HT-29細胞作為研究熱點細胞，源井生物也對其培養(yǎng)體系、基因敲除體系進行了深入的探究，并已在HT-29細胞的基因敲除實驗中實現(xiàn)蛋白層面的完全敲除。

2.如何利用HT-29細胞

目前HT-29細胞被廣泛用于各種基本的細胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究，包括結(jié)直腸癌增殖、相應(yīng)抑制劑的研究、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移等等。

(1) 新合成藥物在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究：例如以HT-29細胞為模型，研究以Abutilon indicum葉提取物為原料制備多酚穩(wěn)定膠體金納米顆粒對結(jié)腸癌細胞的細胞毒作用機制[1]。

(2) 食品工業(yè)殘留物應(yīng)用研究：有研究發(fā)現(xiàn)果汁生產(chǎn)殘留物能有效抑制HT-29細胞增殖，并在不同阻滯點G1、G2/M和S中誘導(dǎo)細胞周期阻滯[2]，這對抗結(jié)腸癌的藥物研發(fā)有一定的推動作用。

(3) 完善結(jié)腸癌形成的分子機制：例如，脯氨酰4 -羥化酶、β多肽(P4HB)與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)P4HB敲低能降低信號轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子3 (STAT3)的激活，并促進活性氧(ROS)的積累，進而誘導(dǎo)HT-29細胞凋亡[3]。

(4) 天然發(fā)酵產(chǎn)物對結(jié)腸癌細胞的作用研究：例如，研究發(fā)現(xiàn)天然發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)actobacillus acidophilus CICC 6074 S-layer 蛋白處理后細胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝結(jié)、核碎裂、液泡等凋亡特征變化，該蛋白可能通過死亡受體凋亡途徑和線粒體途徑誘導(dǎo)HT-29細胞凋亡，并通過抑制PI3K/AKT通路和FasL通路的合成來抑制細胞侵襲[4]。

3.CRISPR/Cas9技術(shù)在HT-29細胞中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種高度特異性的基因編輯方法，可以在細胞或個體層面引發(fā)基因序列的缺失、序列插入和定點突變等，使用催化活性失活的dCas9可以阻斷轉(zhuǎn)錄進而抑制基因表達。 CRISPR/Cas9技術(shù)在HT-29細胞中也有廣泛的應(yīng)用，比如研究發(fā)現(xiàn)在HT-29細胞和原發(fā)人結(jié)腸癌細胞中通過shRNA誘導(dǎo)周期蛋白依賴性激酶(CDK)樣激酶p38γ沉默或CRISPR/ cas9介導(dǎo)的p38γ敲除，都能抑制細胞的生長、增殖和遷移，并顯著誘導(dǎo)細胞的凋亡[7]。

下面具體介紹一個利用CRISPR研究直腸癌細胞耐藥機制的案例[8]，便于大家開拓思路。藥物治療是結(jié)直腸癌患者治療的一種方式，但是持續(xù)用藥會造成結(jié)直腸癌細胞耐藥。5-氟尿嘧啶（5-FU）是一種人工合成的核苷酸類似物，自20世紀(jì)50年代以來一直作為CRC患者化療的主要藥物，主要通過抑制胸苷酸合酶并將其代謝產(chǎn)物摻入DNA，從而導(dǎo)致細胞死亡。 此外，oxaliplatin也可用于結(jié)直腸癌患者的藥物治療，該藥物屬于第三代鉑類藥物，能夠形成鉑- DNA復(fù)合物引發(fā)細胞毒性。

Jinming Yu等人分別利用5-FU和oxaliplatin長時間處理的方式建立了HT-29和SW480耐藥細胞株。通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)REV7(轉(zhuǎn)譯合成聚合酶ζ(POLζ)的關(guān)鍵組成部分)在5-FU和oxaliplatin耐藥的CRC細胞中均上調(diào)（Fig 1. a-d），且在隨著藥物處理濃度的增加，HT-29和SW480中的REV7也呈現(xiàn)遞增的趨勢，表現(xiàn)出劑量依賴性（Fig 1. e-h）。但有趣的是，藥物處理后，REV7 mRNA的表達沒有顯著的差異，也就意味著REV7蛋白的增加不是轉(zhuǎn)錄水平的變化引起的。

Fig 1.

隨后，Jinming Yu等人利用CRISPR/Cas9技術(shù)特異靶向REV7基因，發(fā)現(xiàn)在藥物處理條件下，REV7在REV7缺失細胞株中幾乎不表達（Fig 2. a-b）。plasmid-based TLS efficiency分析發(fā)現(xiàn)REV7缺失顯著抑制了耐藥HT29細胞中的TLS（translesion synthesis）效率，而在補充REV7后，這一現(xiàn)象又會得到緩解（Fig 2. c-d）。

在小鼠異種移植耐藥細胞株模型實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沒有藥物刺激的情況下，REV7的表達不影響腫瘤體積，說明REV7不影響結(jié)直腸癌的發(fā)生。當(dāng)給予藥物刺激時，REV7的缺失會明顯抑制腫瘤生長，但在個體重量方面并沒有顯著差異（Fig 3.）。

Fig 3.

綜上，HT-29細胞作為經(jīng)典的癌細胞模型對于結(jié)直腸癌的研究是十分重要的，而CRISPR/Cas9作為分子水平的研究手段，也起到了十分重要的作用。迄今為止，源井生物已成功利用獨家技術(shù)專利CRISPR-UTM對包括HT-29細胞在內(nèi)的超100種的熱點細胞進行了基因編輯，并在全球范圍內(nèi)提供成熟優(yōu)質(zhì)的基因編輯服務(wù)?，F(xiàn)在所有基因編輯服務(wù)正在進行限時大促：細胞敲除低至1.58萬元、細胞敲入/點突變低至2.98萬元、gRNA載體庫低至388元插入