寫在前面

????????今天推薦的是由德國G?ttingen醫(yī)療中心在2021年5月18日發(fā)表于Oncogene（2020IF：9.867，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Florian Wegwitz教授，研究表明USP22通過抑制未折疊蛋白反應促進HER2驅動的乳腺癌侵襲性。

研究背景

????????泛素特異性蛋白酶22(USP22)是哺乳動物SAGA轉錄共激活復合物的去泛素化亞基。USP22被確定為預測癌癥患者治療失敗的所謂“癌癥死亡”特征的成員。然而，USP22在不同類型和亞型癌癥中的重要性和功能作用仍然未知。

摘要部分

????????在本研究中，作者利用人類細胞系和遺傳小鼠模型來研究USP22在HER2驅動的乳腺癌（HER2+-BC）中的作用，并首次證明USP22是小鼠和人類HER2+-BC模型中致瘤性所必須的。為了深入了解潛在的機制，作者進行了全轉錄組的基因表達分析，并確定未折疊蛋白反應（UPR）是USP22缺失后失調的途徑。UPR通常在外在或內在的壓力下被誘導，如果短期內被激活，可以促進細胞的生存和恢復，如果長期被激活，則可以促進細胞的程序性死亡。作者發(fā)現USP22通過穩(wěn)定內質網（ER）伴侶HSPA5，積極抑制HER2+-BC細胞的UPR誘導。一致的是，USP22的缺失使腫瘤細胞對細胞凋亡更加敏感，并明顯增加了靶向ER折疊能力的治療方法的效率?？傊?，作者的數據表明，針對USP22活性的治療策略可以使腫瘤細胞對UPR誘導敏感，并可能提供一種新的、有效的方法來治療HER2+-BC。

研究內容

1.USP22促進HER2驅動的體內乳腺癌發(fā)生

????????對TCGA乳腺癌隊列中HER2+-BC患者的分析證實，具有高USP22表達的腫瘤患者的預后特別差。為了研究HER2驅動的乳腺癌中Usp22確實的后果，作者使用了轉基因小鼠模型，其中編碼HER2的基因(Erbb2)在乳腺特異性MMTV啟動子(MMTV-Erbb2)下表達。Usp22的乳腺特異性缺失是通過將含有floxedUsp22等位基因(Usp22flox)的小鼠品系與乳腺特異性缺失品系MMTV-Cre雜交實現的。隨后對腫瘤發(fā)生的監(jiān)測顯示，與Usp22wt/wt動物相比，組織特異性Usp22敲除動物的無病生存期顯著增加。值得注意的是，12.5%的Usp22fl/fl小鼠從未患上這種疾病，這表明Usp22在HER2驅動的BC中起著關鍵作用。進一步的分析表明，Usp22缺失不僅延遲了腫瘤生長，而且還大大降低了腫瘤負荷，這體現在每只動物的腫瘤數量減少和腫瘤生長動力學減慢。作者通過qRTPCR證實了敲除Usp22fl/fl腫瘤的效率。有趣的是，生長腫瘤的形態(tài)和H2B單泛素化(H2Bub1)水平都不受Usp22缺失的影響。此外，免疫組織化學分析證實，該腫瘤模型中驅動癌基因HER2的表達不受Usp22缺失的影響。

研究結論：USP22在HER2驅動的BC中具有關鍵的腫瘤促進作用。

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2.USP22缺失損害了HER2+-BC細胞體外的致癌特性

????????為了將作者的觀察擴展到其他人類疾病，作者使用了兩種HER2+人類BC細胞系（HCC1954和SKBR3），并首先研究了USP22確實對其致癌特性的影響。USP22的缺失導致兩種細胞系的細胞數量、克隆生長和遷移特性顯著減少。為了評估USP22的缺失是否影響HER2信號級聯反應，作者探究了USP22缺失后HER2的兩個主要下游分子靶標ERK1/2和AKT的磷酸化。與導致pERK1/2和pAKT顯著降低的HER2抑制劑拉帕替尼治療相比，作者沒有觀察到HCC1954中USP22缺失后HER2下游信號轉導的顯著變化。與觀察到的增殖效應一致，與對照轉染細胞相比，HCC1954細胞中USP22沉默后PCNA表達降低。

研究結論：USP22的缺失會在體外和體內干擾HER2+-BC細胞的致瘤性，而不影響HER2表達或其典型的下游信號級聯反應。

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3.USP22缺失觸發(fā)HER2+-BC細胞凋亡

????????作者通過全轉錄組分析，在小鼠腫瘤中鑒定出Usp22缺失后的1141個差異調節(jié)基因，以及HCC1954細胞中USP22敲低后的496個差異調節(jié)基因。隨后，作者通過使用基因集富集分析(GSEA)并將體外和體內結果相交，研究了USP22缺陷條件下的常見調控途徑。作者觀察到，在HCC1954和HER2驅動的小鼠腫瘤中USP22受損時，大多數顯著富集的基因集基本上重疊。有趣的是，缺乏USP22的HER2+-BC腫瘤細胞顯示出與應激誘導的信號通路和細胞凋亡相關的基因特征的富集。為了評估USP22缺失是否確實誘導HER2+-BC細胞凋亡，作者首先檢查了USP22敲低后的細胞形態(tài)，并觀察到程序性細胞死亡的特征。通過評估裂解的PARP的水平以及通過基于流式細胞術的annexin V測定進一步證實了細胞凋亡的誘導。一致地，通過RT-qPCR和IHC染色測量的Usp22fl/fl乳腺癌中凋亡誘導劑Caspase3及其活性裂解形式的水平升高。符合預期的是，用泛半胱天冬酶抑制劑Z-VAD處理幾乎完全恢復了USP22缺陷型HCC1954細胞的細胞活力。

研究結論：USP22缺失會在體內和體外觸發(fā)HER2+-BC細胞的凋亡誘導。

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4.USP22缺失增加了HER2+-BC對未折疊蛋白反應的敏感性? ? ?

????????為了闡明USP22缺陷型HER2+-BC細胞凋亡增加的分子機制，作者重點研究了通常在體外和體內上調的“HALLMARK_APOPTOSIS”特征基因。促凋亡激活轉錄因子3(ATF3)基因特別引起了作者的注意。在HER2驅動的鼠腫瘤和HCC1954細胞中，通過qRT-PCR驗證了ATF3和另一種促凋亡因子BCL10的mRNA水平增加。因此，IHC染色顯示Usp22fl/fl腫瘤中ATF3的水平與其野生型對應物相比顯著增加。值得注意的是，在siUSP22和Usp22fl/fl腫瘤細胞中都觀察到了在其啟動子中包含至少一個ATF3結合位點的上調基因的顯著富集。? ? ?

????????ATF3經常在各種細胞應激條件下激活，包括缺氧和內質網(ER)應激。作者假設USP22減少后ATF3表達水平的增加是由于持續(xù)的內質網應激所致。為了測試更高水平的ATF3和在HER2+-BC中丟失USP22時受損的腫瘤表型是否是由UPR的持續(xù)激活引起的，作者分析了受該途徑調節(jié)的幾種已知標志物和基因。有趣的是，在siUSP22處理的HCC1954細胞中，磷酸化eIF2a（peIF2a）和ATF4的水平升高。在體內，與野生型腫瘤相比，Usp22fl/fl腫瘤中的ATF4蛋白水平也顯著增加。一致地，人類HER2+-BC全轉錄組數據集（TCGABRCA數據集）的GSEA表明，與USP22high腫瘤相比，USP22low病變也具有升高的UPR信號。因此，在HER2+-BC患者中觀察到USP22表達與幾種UPR反應基因之間存在顯著負相關?？傊?，作者的結果支持USP22在控制UPR信號中的負調控作用。

????????如上所述，PERK在UPR的激活中起著核心作用?；谧髡叩陌l(fā)現，在USP22缺失后p-eIF2A和ATF4水平均增加，同時體內和體外模型中PERK介導的UPR基因表達特征的富集，作者假設USP22可能會抑制PERK激活以維持癌細胞中的低UPR水平。為了驗證這一假設，作者在HCC1954和SKBR3細胞中敲低了USP22，并檢查了用PERK抑制劑(PERKi)GSK2606414治療的效果。有趣的是，PERK的抑制不僅逆轉了UPR反應基因的激活，而且還有效地挽救了UPS22耗竭引起的與細胞凋亡相關的PARP裂解和兩個細胞系的細胞生存能力。

研究結論：USP22促進致瘤表型并通過維持低UPR信號降低HER2+-BC細胞的凋亡率。

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5.USP22通過穩(wěn)定HSPA5抑制UPR誘導的HER2+-BC細胞凋亡? ? ?

????????USP22已被證明可以去泛素化其他幾種細胞蛋白。值得注意的是，最近的泛素組范圍分析將熱休克蛋白5（HSPA5）確定為前列腺癌細胞中USP22介導的去泛素化的靶點。鑒于HSPA5是PERK活性的主要調節(jié)因子，作者假設USP22可能通過去泛素化和穩(wěn)定HSPA5來抑制UPR激活。作者發(fā)現，USP22沉默特異影響HSPA5蛋白水平，而不影響兩種人HER2+-BC細胞系中的HSPA5 mRNA表達。類似地，盡管與野生型腫瘤相比，Usp22fl/fl腫瘤表現出Hspa5基因表達的顯著增加，但免疫組織化學染色顯示HSPA5蛋白水平顯著降低。通過USP22介導的去泛素化直接穩(wěn)定HSPA5表明這兩個因素可能共定位于ER。由于尚未報告USP22其在ER室中的存在，因此，作者對USP22進行了免疫染色，并通過共聚焦顯微鏡檢查了它在ER的定位，并且通過用ER特異性染色標記來確認其在ER中的存在。USP22免疫染色的特異性通過siRNA介導的沉默進行了驗證。

????????作者還發(fā)現USP22與HSPA5發(fā)生免疫共沉淀，說明兩者在細胞中發(fā)生物理相互作用。重要的是，用蛋白酶體抑制劑硼替佐米處理HCC1954細胞在USP22敲低后恢復了HSPA5水平，進一步證實了USP22通過防止泛素-蛋白酶體系統降解HSPA5在穩(wěn)定HSPA5中的核心作用。一致地，放線菌酮追蹤分析表明，與對照轉染細胞相比，USP22丟失后HSPA5的穩(wěn)定性顯著縮短。總之，這些結果證明了USP22在穩(wěn)定HER2+-BC中的HSPA5方面的作用。與HSPA5low患者相比，具有HSPA5高表達病變的HER2+-BC患者的生存結果較差。因此，作者測試了HSPA5活性的損害是否可以表型復制USP22的缺失并誘導UPR。事實上，通過誘導HCC1954和SKBR3細胞中的ATF3、PPP1R15A、DDIT3、BCL10和CREB5基因表達來衡量，使用特異性抑制劑HA15抑制HSPA5導致UPR信號的顯著激活。此外，HA15處理還增加了HCC1954細胞的凋亡率。一致地，HSPA5抑制或缺失顯著降低了HER2+-BC細胞活力，并且這些效應可以通過USP22敲低來加強。作者的研究揭示了USP22通過穩(wěn)定HSPA5來抑制UPR信號激活方面的未知作用。作者的結果進一步表明表達低水平USP22的HER2+-BC細胞對UPR誘導的脆弱性。

研究結論：USP22維持HSPA5的穩(wěn)定性并抑制HER2+-BC的UPR誘導的細胞凋亡。

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結論與討論

????????總之，作者的工作確定了USP22在抑制UPR信號方面的致癌功能，揭示了它在支持細胞蛋白伴侶系統和保護腫瘤細胞免受蛋白態(tài)失衡影響方面的全球性作用。因此，可以假設，抑制USP22的活性可以代表一種針對HER2+-BC的創(chuàng)新方法，同時對UPR信號的藥理刺激可以增強這些效果。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41388-021-01814-5