NMT發(fā)現(xiàn)楊樹抗旱耐鹽基因編輯新種質(zhì)維持鈉/鉀/鈣/氫離子穩(wěn)態(tài)能力強
基本信息
主題：NMT發(fā)現(xiàn)楊樹抗旱耐鹽基因編輯新種質(zhì)維持鈉/鉀/鈣/氫離子穩(wěn)態(tài)能力強 為解析其抗逆機制提供了關(guān)鍵依據(jù)
期刊：Plant Biotechnology Journal
影響因子：13.8
研究使用平臺：NMT植物抗逆創(chuàng)新平臺
標題：A breeding strategy for improving drought and salt tolerance of poplar based on CRISPR/Cas9
作者：中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所、林木遺傳育種全國重點實驗室蘇曉華、丁昌俊、張騰倩、張偉溪
獲獎情況：該成果獲得2022-2023年度“中關(guān)村優(yōu)秀NMT成果獎”一等獎
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檢測離子/分子指標
Na+、K+、H+、Ca2+
檢測樣品
楊樹根（距根尖600 μm處根表上的點）
供稿人簡介
中文摘要
我國干旱和半干旱地區(qū)約占國土面積50%以上，其人工林成活率、保存率低于30%；鹽堿地總面積高達9900萬hm2，約占全國陸地面積的10.3%，且每年以1.5%的速度增長。隨著全球氣候變化，國家生態(tài)環(huán)境建設(shè)、碳中和等重大戰(zhàn)略實施，迫切需要快速培育逆境適應(yīng)能力強的林木新品種，實現(xiàn)對干旱、半干旱及鹽堿荒地等困難立地的綠化栽培和改良利用，為國土生態(tài)安全維護、固碳增匯等提供優(yōu)良種植材料。本研究以我國北方地區(qū)栽植的楊樹重要樹種84K楊（Populus alba?×?P. glandulosa）為材料，挖掘出主要在其根部表達的鹽和干旱脅迫響應(yīng)調(diào)控因子基因（富含脯氨酸蛋白等位基因PagHyPRP1，PagHyPRP1A和PagHyPRP1B），并利用優(yōu)化CRISPR/Cas9系統(tǒng)對該基因進行多位點基因組精準編輯。共獲得9株P(guān)agHyPRP1編輯植株，編輯效率達60%。編輯株系的PagHyPRP1表達水平無論在正常生長還是在鹽和干旱脅迫條件下均顯著低于野生型84K楊（WT），而過表達株系（OE）的PagHyPRP1表達水平則顯著高于野生型，且Paghprp1基因編輯株系在干旱和鹽脅迫下的株高、莖徑、莖重、根干重和根冠比顯著增加，耐鹽性和抗旱性顯著增強，證明PagHyPRP1基因在楊樹響應(yīng)干旱和鹽堿脅迫中的負調(diào)控作用。與WT相比，Paghyprp1編輯株系表現(xiàn)出更高的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性以及脯氨酸含量，更低的過氧化氫（H2O2）、超氧根離子（O2-）以及活性氧（ROS）的積累；較高的Na+外排（鹽脅迫下）、Ca2+內(nèi)流量（干旱脅迫下）和H+內(nèi)流量，更少的K+外排，而OE株系卻表現(xiàn)與之相反。表明Paghyprp1基因編輯株系通過提高POD、SOD等抗氧化酶活性、降低ROS、H2O2等活性氧的積累、減少細胞的膜質(zhì)氧化程度、促進根系生長，同時維持根系Na+、K+、H+和Ca2+離子平衡，穩(wěn)定根系滲透平衡，進而提高了植株的抗旱耐鹽能力。
離子/分子流實驗處理方法
45?天苗齡楊樹150 mM NaCl脅迫14 d?；20% PEG脅迫7 d。
離子/分子流實驗結(jié)果
為了研究基因編輯楊樹在ROS信號傳導(dǎo)中對干旱和鹽脅迫的反應(yīng)，測定了根系的關(guān)鍵離子流速和相關(guān)基因表達。如圖1p，q所示，突變體中RBOHF的低表達產(chǎn)生適當?shù)腞OS信號，如H2O2，其可以激活各種Ca2+通道，并被HPCA1感知以促進細胞外Ca2+內(nèi)流。在干旱模擬脅迫下，Ca2+信號可以激活CPK1和其他CPKS，促進Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并觸發(fā)對脅迫的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。同時，CPK1的過量表達還可以促進更多的Ca2+內(nèi)流（WT的1.19-1.35倍）。另一方面，編輯株系可能通過上調(diào)PMA和AKT的表達來增加H+的內(nèi)流（WT的1.27-1.43倍）和抑制K+外排（WT的0.60-0.72倍）。胞內(nèi)的高離子濃度有利于形成更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，降低細胞內(nèi)的水勢，有利于滲透壓平衡，進而提高突變體的耐旱性。同樣，在鹽脅迫下，適當?shù)腞OS可能形成“ROS-Ca2+”樞紐來激活SOS信號通路（Chen et al.，2021），從而提高SOS1和NHX1的表達，激活Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白以促進Na+外排（WT的1.38-1.59倍）和H+內(nèi)流（WT的1.45-1.70倍）。此外，突變體中AKT1和PMA表達的增加可能限制K+流出（是WT的0.63-0.78倍）并增強H質(zhì)子泵能力，維持細胞內(nèi)Na+/K+的平衡，進而增強突變體的耐鹽能力。
圖1 干旱脅迫下各株系Ca2+、K+和 H+離子流速。正值代表離子外排，負值代表離子吸收
（a）Ca2+離子流；（b）K+離子流；（c）H+離子流；*，**表示paghyprp1株系和OE株系與WT間差異顯著（*P< 0.05，**P < 0.01）；#，##表示paghyprp1株系和WT與OE株系間差異顯著（#P< 0.05，## P< 0.01）
圖2 鹽脅迫下各株系Na+、K+和 H+離子流速。正值代表離子外排，負值代表離子吸收
（a）：Na+離子流；（b）：K+離子流；（c）：H+離子流；*，**，#，##同上
其他實驗結(jié)果
??與野生84K相比，編輯株系的PagHyPRP1的表達水平無論在正常生長條件下還是鹽和干旱脅迫下均顯著降低，過表達OE株系的PagHyPRP1表達水平則相反，證實楊樹PagHyPRP1基因在干旱和鹽堿脅迫下的負調(diào)控作用。
??共獲得9株（5種基因型）PagHyPRP1編輯植株，編輯效率高達60%。
??在干旱和鹽脅迫下，paghprp1編輯株系株高、地徑、莖重、根干重和根冠比顯著增加，耐鹽性和抗旱性顯著增強。
??與WT相比，paghyprp1編輯株系表現(xiàn)出更高SOD、POD活性及脯氨酸含量，更低H2O2、O2-及ROS的積累。
結(jié)論
該研究首次證實了楊樹富含脯氨酸蛋白等位基因PagHyPRP1為鹽和干旱脅迫響應(yīng)負調(diào)控因子基因，為林木基因編輯育種提供了重要價值的候選基因；創(chuàng)制出抗旱耐鹽性狀明顯改良的基因編輯楊樹，填補了林木特別是世界人工林主栽大樹種抗逆基因編輯育種的空白，為應(yīng)用CRISPR/Cas9等基因組編輯技術(shù)創(chuàng)制突破性林木新種質(zhì)提供實證和技術(shù)參考。研究還發(fā)現(xiàn)不同突變類型（純合、等位基因突變、嵌合突變）基因編輯的楊樹抗旱耐鹽能力均得到有效提高，為針對基因組雜合度高等林木自身特點的基因編輯新策略建立提供新思路。
測試液
0.1 mM KCl，0.1 mM CaCl2，1.0 mM NaCl，pH6.0
供稿：張偉溪
編輯：葉斌，劉兆義
關(guān)鍵詞：Ca2+；K+；H+；Na+；鹽脅迫；干旱脅迫；楊樹；根；植物類
