6月19日，Cell Research發(fā)表了上海復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院與華大集團(tuán)共建的“中?華精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心”、華大生命科學(xué)研究院和復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院等單位合作的研究成果。該研究基于華大自主研發(fā)的時(shí)空組學(xué)技術(shù)Stereo-seq和單細(xì)胞建庫(kù)平臺(tái)DNBelab C4，系統(tǒng)研究腫瘤組織（tumor tissues，T）、腫瘤邊緣區(qū)域（tumor margin areas，M）、腫瘤旁組織（paratumor tissues，P），以及正常或轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)（lymph nodes，LN）的細(xì)胞組成和轉(zhuǎn)錄特征，全面描述了肝癌中500 μm浸潤(rùn)區(qū)獨(dú)特的局部生態(tài)系統(tǒng)，并確定腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和肝細(xì)胞之間存在活躍的串?dāng)_，這可能有助于開發(fā)肝癌和其他實(shí)體瘤的新治療策略。以下是文章的詳細(xì)解讀。

文章題目：An Invasive Zone in Human Liver Cancer Identifified by Stereo-seq Promotes Hepatocyte–Tumor Cell Crosstalk, Local Immunosuppression and Tumor Progression

發(fā)表時(shí)間：2023-06-19

發(fā)表期刊：Cell Research

主要研究團(tuán)隊(duì)：中?華精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心、深圳華大生命科學(xué)研究院、西南華大生命科學(xué)研究院、杭州華大生命科學(xué)研究院和復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院等

影響因子：46.297

DOI：10.1038/s41422-023-00831-1

研究背景

實(shí)體腫瘤是具有高度異質(zhì)性的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，其中涉及癌細(xì)胞與各種細(xì)胞類型（包括免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)）的相互作用。解剖腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，尤其是腫瘤邊緣周圍的生態(tài)系統(tǒng)，可以深入理解腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和侵襲機(jī)制，對(duì)于探索腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制和開發(fā)有效的新療法也至關(guān)重要。

肝癌，包括肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC），是一些最常見和最具有侵襲性的腫瘤類型，由于治療選擇有限且效果不理想，全球肝癌發(fā)病率和死亡率都很高。本研究中，研究人員利用Stereo-seq和scRNA-seq聯(lián)合分析，揭示了人類肝癌腫瘤侵襲前沿特征，為開發(fā)肝癌和其他實(shí)體腫瘤的新治療策略鋪平了道路。

研究樣本

Stereo-seq：21例病理診斷為原發(fā)性肝癌的患者（6例HCC，15例ICC）中的53份新鮮或新鮮冷凍樣本（包括12份T，21份M，10份P，10份LN），共計(jì)98張切片。

scRNA-seq：5例原發(fā)性肝癌患者（1例HCC，4例ICC）的16份樣本（5份T，5份M，2份P，4份LN）。

研究成果

1. 人類原發(fā)性肝癌四個(gè)組織區(qū)域的空間轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性

為了系統(tǒng)地表征人類肝癌的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)，研究人員使用具有納米級(jí)分辨率（直徑 220 nm/spot）和厘米級(jí)全景視場(chǎng)（10 mm×10 mm）的時(shí)空組學(xué)技術(shù)Stereo-seq，分析來自肝癌患者的新鮮或新鮮冷凍T、P、M，以及正?；蜣D(zhuǎn)移性LN樣本，同時(shí)結(jié)合基于單細(xì)胞建庫(kù)平臺(tái)DNBelab C4的scRNA-seq技術(shù)，獲得了33,111個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并將其與公開發(fā)布的ICC scRNA-seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合，建立一個(gè)無偏參考圖譜，以定義Stereo-seq切片中不同細(xì)胞群的細(xì)胞類型（圖1a）。

以scRNA-seq數(shù)據(jù)為參考，利用SPOTlight計(jì)算組織切片中每個(gè)點(diǎn)（bin 50）的細(xì)胞成分，共注釋得到了9種主要細(xì)胞類型：B細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，以及其他兩種細(xì)胞類型（腫瘤細(xì)胞和膽管細(xì)胞合并為一種主要細(xì)胞類型；T細(xì)胞和NK細(xì)胞合并為一種主要細(xì)胞類型）（圖1b）。

肝癌中四個(gè)區(qū)域（T、M、P和LN）的細(xì)胞組成和空間分布具有高度異質(zhì)性，除主要的腫瘤細(xì)胞和肝細(xì)胞外，T/NK細(xì)胞、B細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是最豐富的細(xì)胞（圖2a）。根據(jù)病理學(xué)家基于相鄰H&E染色圖像確定的腫瘤邊界，邊緣區(qū)域在空間上分為邊緣區(qū)域的腫瘤相鄰部分 (tumor-adjacent part of margin areas，M-T) 和腫瘤旁部分 (paratumor part of margin areas，M-P)。

研究人員觀察到，腫瘤組織中的內(nèi)皮細(xì)胞和漿細(xì)胞多于其他區(qū)域，而成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞傾向于富集在M-T而不是腫瘤組織，B細(xì)胞在 LNs中最豐富；與P相比，M-P富集了更多的成纖維細(xì)胞（圖2b）。在空間上，巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞主要富集在腫瘤邊界的邊緣區(qū)域，表明腫瘤邊界周圍存在獨(dú)特的免疫微環(huán)境（圖2a、2c）。

為了研究不同腫瘤區(qū)域的微環(huán)境，研究人員對(duì)組織區(qū)域進(jìn)行分割（1000 bins×1000 bins或每個(gè)spot 500 μm×500 μm，bin1000），以獲取局部bulk RNA圖譜作為一個(gè)微環(huán)境單元，每張切片上約有400個(gè)單元，共獲得39,200個(gè)單位。結(jié)果顯示，M可能是一個(gè)復(fù)雜的區(qū)域，其特征是微環(huán)境缺氧、炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈和免疫逃逸率高（圖2d）。

2. 沿腫瘤侵襲邊界區(qū)域的切線和法線方向的特征

為了全面剖析肝癌腫瘤侵襲邊界區(qū)域的局部微環(huán)境，研究人員利用一種新的分割方法，即掃描數(shù)字化模型（scanning and digitization model，SDM），來進(jìn)一步研究腫瘤侵襲邊界區(qū)域兩側(cè)的特征（圖3a），觀察到不同的局部空間腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironments，TMEs）特征：腫瘤侵襲邊界周圍存在免疫抑制微環(huán)境，免疫細(xì)胞顯著富集，包括距離腫瘤側(cè)邊界第一層（0~250 μm）的巨噬細(xì)胞（特別是M2-like表型）、T/NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）和B細(xì)胞（圖3b~3f）。

研究人員進(jìn)一步表征腫瘤侵襲邊界區(qū)域腫瘤細(xì)胞和其他細(xì)胞成分（主要是肝細(xì)胞）中癌癥標(biāo)志物的存在和代謝變化，確定了一個(gè)獨(dú)特的侵襲區(qū)域（以腫瘤邊界兩側(cè)為中心的500 μm寬的區(qū)域），并定義為“侵襲前沿”。侵襲前沿具有免疫抑制環(huán)境占主導(dǎo)地位、脂肪酸代謝能量供應(yīng)增加、腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）能力增強(qiáng)，以及肝細(xì)胞嚴(yán)重受損的特點(diǎn)（圖3f、3g）。

為了分析沿腫瘤侵襲邊界可能存在的空間異質(zhì)性，研究人員進(jìn)一步分析了侵襲區(qū)沿邊界切線方向的細(xì)胞多樣性和狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)與亞區(qū)域其他細(xì)胞組成模式（模式1：成纖維細(xì)胞為主；模式2：成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主；模式4：B細(xì)胞和T/NK細(xì)胞為主；模式5：內(nèi)皮細(xì)胞為主）相比，腫瘤復(fù)發(fā)患者中顯著富集模式3（巨噬細(xì)胞為主），提示浸潤(rùn)區(qū)域中巨噬細(xì)胞可能是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素（圖3h~3j）。

3. 侵襲區(qū)JAK-STAT3激活誘導(dǎo)受損肝細(xì)胞亞型SAAs的高表達(dá)

為進(jìn)一步表征肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及這種反應(yīng)在腫瘤侵襲中的作用，研究人員將來自腫瘤旁側(cè)三層（0~250 μm、250~500 μm和500~750 μm區(qū)域）的肝細(xì)胞重新聚類，鑒定了兩種肝細(xì)胞亞型（Hep1和Hep2），其中Hep1表現(xiàn)出更高的SAA1和SAA2（血清淀粉樣蛋白A1和A2；統(tǒng)稱為SAAs）表達(dá)水平，并顯著富集在最靠近腫瘤旁邊界的 250 μm寬區(qū)域內(nèi)（圖4a、4b）。研究人員通過進(jìn)一步分析組織切片中接近Hep1富集區(qū)域和其余區(qū)域的腫瘤細(xì)胞之間的差異基因表達(dá)，確認(rèn)肝癌腫瘤細(xì)胞可以通過分泌CXCL6并隨后在侵襲區(qū)激活JAK-STAT3通路來誘導(dǎo)肝細(xì)胞中 SAAs的過表達(dá)（圖4f~4l）。

4. SAAs+肝細(xì)胞亞型有助于巨噬細(xì)胞的募集和M2極化

為了探索侵襲區(qū)中SAAs+肝細(xì)胞（Hep1）的功能，研究人員基于邊緣區(qū)域的scRNA-seq數(shù)據(jù)，使用CellPhoneDB觀察配體-受體對(duì)來分析細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間觀察到最強(qiáng)的雙向通訊，有超過25個(gè)顯著相互作用的配體-受體對(duì)（圖5a）。表達(dá)SAAs受體編碼基因（FPR1、FPR2、TLR4、TLR2、SCARB1和CD36）的巨噬細(xì)胞在空間上富集在侵襲區(qū)Hep1亞型細(xì)胞附近，進(jìn)一步的定量分析顯示，SAAs受體+巨噬細(xì)胞在第一層（距腫瘤邊界0~250 μm）腫瘤側(cè)富集，這支持了侵襲區(qū)受損肝細(xì)胞通過分泌SAAs來募集巨噬細(xì)胞（圖5b~5f）。

使用scRNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)配體-受體相互作用的分析進(jìn)一步表明，侵襲區(qū)的肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也可以通過SAAs-TLR2相互作用，這已被證明可以使巨噬細(xì)胞極化為M2樣表型（圖5b）。此外，腫瘤細(xì)胞還可以通過侵襲區(qū)的CSF1-CSF1R或CSF1-SIRPA相互作用，直接使巨噬細(xì)胞極化為M2樣表型（圖6a）。侵襲區(qū)巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出M2樣表型，CD163、MRC1和SAAs受體TLR2表達(dá)上調(diào)，而腫瘤組織中巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞外基質(zhì)重塑特征，MMP9和MMP14表達(dá)上調(diào)（圖6b）。

5. SAAs+肝細(xì)胞亞型與腫瘤進(jìn)展相關(guān)

接下來，研究人員探討了受損肝細(xì)胞和侵襲區(qū)募集的巨噬細(xì)胞的臨床意義。結(jié)果顯示，侵襲區(qū)高比例的SAAs+肝細(xì)胞與原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)（圖6c、6d）。為驗(yàn)證是否能通過調(diào)控SAAs的表達(dá)來控制腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展和侵襲，研究人員利用小鼠原位肝癌和腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，在體內(nèi)特異性轉(zhuǎn)染以降低正常肝細(xì)胞的SAAs表達(dá)，發(fā)現(xiàn)可以減少侵襲區(qū)巨噬細(xì)胞富集程度，同時(shí)腫瘤生長(zhǎng)也得以延緩（圖6e~6i）。

上述表明，巨噬細(xì)胞通過侵襲區(qū)受損肝細(xì)胞分泌SAAs被特異性募集并極化為M2表型（圖7）。這導(dǎo)致了局部微環(huán)境的免疫抑制增強(qiáng)，并促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展。Saas的敲除抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，表明SAAs抑制可能是原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌的潛在治療策略。

?總? ?結(jié)?

本研究中，研究人員聯(lián)合Stereo-seq和scRNA-seq，首次解析了肝癌腫瘤細(xì)胞侵襲正常肝細(xì)胞過程中的交界線周圍區(qū)域的細(xì)胞組成、分子特征及交互作用，確定并描述了一個(gè)以腫瘤邊界為中心的獨(dú)特的、500 μm寬的“侵襲前沿”。該侵襲前沿包含一個(gè)復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的局部腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，可以決定腫瘤侵襲的風(fēng)險(xiǎn)和患者的預(yù)后。此外，該研究證實(shí)了SDM方法可用于探索腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，以表征癌癥中存在的空間異質(zhì)性，這為開發(fā)肝癌和其他實(shí)體瘤的更精確、更有效的治療方法奠定了基礎(chǔ)。

本研究由上海復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院與華大集團(tuán)共建的“中?華精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心”、深圳華大生命科學(xué)研究院、西南華大生命科學(xué)研究院、杭州華大生命科學(xué)研究院、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院等多個(gè)科研團(tuán)隊(duì)共同完成。吳靚、閆加艷、白寅琪、陳霏雨、鄒軒軒、許江山和黃傲為該論文的共同第一作者，周儉、陳奧、楊欣榮和劉石平為論文的共同通訊作者。

本研究嚴(yán)格遵照倫理規(guī)范開展，相關(guān)數(shù)據(jù)已完成中國(guó)人類遺傳資源信息開放使用備案。