慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體。慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，可有效地感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，所以慢病毒載體能大大提高目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，能夠方便快捷地實(shí)現(xiàn)基因的長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)。

在使用慢病毒的過(guò)程中，可能因病毒的濃度、細(xì)胞的狀態(tài)、操作規(guī)范和時(shí)間把握等出現(xiàn)各種問(wèn)題，今天小恒就來(lái)和大家聊一聊在使用慢病毒過(guò)程可能會(huì)遇到的問(wèn)題，如何解決這些問(wèn)題~

1、什么是MOI？如何通過(guò)MOI計(jì)算需要加入的病毒量？

MOI，感染復(fù)數(shù)，是指每個(gè)細(xì)胞感染的病毒數(shù)，通常需要MOI值越高的細(xì)胞越難被感染。一般我們把某株細(xì)胞有80%被感染時(shí)所用的病毒顆粒數(shù)和細(xì)胞數(shù)目的比值作為該株細(xì)胞的MOI。

相關(guān)計(jì)算公式：每孔加病毒量（μL）=MOI*細(xì)胞數(shù)/病毒滴度（TU/mL）×1000

MOI=（病毒滴度x病毒體積）/細(xì)胞數(shù)目

2、如何確定向細(xì)胞中加入慢病毒的最佳時(shí)間？

慢病毒感染細(xì)胞后2~3天可觀察慢病毒攜帶的基因熒光表達(dá)情況，在細(xì)胞匯合度30~50%且細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)加入慢病毒，確保在感染后2天時(shí)細(xì)胞增長(zhǎng)達(dá)到70%左右的匯合度。

3、用于慢病毒感染的細(xì)胞接種量是多少？

根據(jù)細(xì)胞增殖的速度調(diào)整細(xì)胞接種量，以保證在感染后3天左右細(xì)胞剛好快長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部為宜。

針對(duì)大部分細(xì)胞系：傳代周期在2~3天，感染時(shí)細(xì)胞鋪板的密度保持在30~50%左右

針對(duì)某些原代細(xì)胞：由于細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢，可以在接種時(shí)提高匯合度到70~80%左右

針對(duì)非分裂細(xì)胞：如神經(jīng)元細(xì)胞，接種后不再增殖，此時(shí)可以按照100%的匯合度進(jìn)行接種。

4、慢病毒感染細(xì)胞后什么時(shí)間基因表達(dá)到達(dá)峰值？

慢病毒感染后大部分細(xì)胞會(huì)在3天左右GFP或目的基因表達(dá)達(dá)到峰值，但是對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞，達(dá)到峰值的時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)。

5、對(duì)照病毒或目的病毒感染細(xì)胞以后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變或者細(xì)胞死亡？

首先，確定病毒是否有污染，常見污染類型及處理方法：

①?細(xì)菌污染，病毒用Millipore 0.22um濾器過(guò)濾去除細(xì)菌；

②?真菌污染，病毒直接丟棄

③ 支原體污染，可用漢恒抗支原體試劑

漢恒慢病毒產(chǎn)品嚴(yán)格質(zhì)檢，確保慢病毒產(chǎn)品沒有支原體污染。市場(chǎng)上有些慢病毒供應(yīng)商為了降低成本縮短周期，削減支原體污染檢測(cè)工序，不僅影響客戶的實(shí)驗(yàn)成敗，更給客戶細(xì)胞房污染造成潛在影響。

④ 病毒純度不夠：與供應(yīng)商聯(lián)系確認(rèn)慢病毒產(chǎn)品是否經(jīng)過(guò)超速離心純化！目前市場(chǎng)上很多低價(jià)慢病毒產(chǎn)品僅經(jīng)過(guò)初步純化，未使用超速離心機(jī)進(jìn)行純化；

漢恒慢病毒產(chǎn)品全部經(jīng)過(guò)超速離心純化，尤其適合對(duì)雜質(zhì)敏感的細(xì)胞株！

其次，確定病毒感染MOI是否過(guò)高，降低MOI值，并在感染后的4h、8h、12h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)，則需要使用新鮮的完全培養(yǎng)液替換病毒感染培養(yǎng)液。

排除以上因素后細(xì)胞狀態(tài)仍然不好，嘗試增加血清含量，觀察細(xì)胞狀態(tài)是否好轉(zhuǎn)。

6、如何提高慢病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率？

慢病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率受多種因素影響，如病毒活性、細(xì)胞自身的狀態(tài)、MOI值、感染時(shí)間等。

①病毒活性，解凍病毒一定要在冰上進(jìn)行，盡量避免反復(fù)凍融。-80℃保存半年以上需要重新測(cè)滴度；

②目的細(xì)胞，先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，看病毒載體是否合適感染目的細(xì)胞。一些難感染的細(xì)胞，如貼壁不好的細(xì)胞，原代細(xì)胞等適合用腺病毒；對(duì)于懸浮細(xì)胞，可采用離心感染的方法，減少病毒感染時(shí)的體積，從而提升感染的效率；

③ MOI值，進(jìn)行MOI梯度摸索實(shí)驗(yàn)，找出最優(yōu)的MOI濃度；

④?感染時(shí)間，慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒一般在感染后24h換液，太早換液會(huì)導(dǎo)致感染效率下降；換液太晚，則對(duì)細(xì)胞的損傷太大。感染后48h開始觀察熒光，由于慢病毒表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)，有的72h、120h才能看到熒光；

⑤?助轉(zhuǎn)劑，Polybrene有一定的細(xì)胞毒性，不同細(xì)胞對(duì)polybrene的敏感度不同，可以用1-10ug/mL的范圍篩選合適的濃度,以24h內(nèi)細(xì)胞無(wú)明顯毒性反應(yīng)為佳；

PS：慢病毒帶puromycin抗性的可以用嘌呤霉素篩選，也可提高陽(yáng)性細(xì)胞率。

7、細(xì)胞能被慢病毒感染，但為何GFP熒光很弱？

GFP慢病毒感染細(xì)胞后，熒光強(qiáng)度取決于病毒進(jìn)入到細(xì)胞的顆粒數(shù)、細(xì)胞本身的增殖狀態(tài)、細(xì)胞類型、觀察時(shí)間、GFP前的啟動(dòng)子活性等因素。

GFP基因熒光表達(dá)的強(qiáng)度與啟動(dòng)子的活性、目的細(xì)胞感染的病毒顆粒數(shù)呈正相關(guān)。慢病毒在增值較快的細(xì)胞中感染72~120ｈ，GFP蛋白表達(dá)才達(dá)到峰值；在增殖較慢的細(xì)胞中感染后，GFP蛋白表達(dá)到達(dá)峰值需要更久。GFP基因接在強(qiáng)啟動(dòng)子后面時(shí)熒光表達(dá)較強(qiáng)，弱啟動(dòng)子則熒光表達(dá)較弱。

觀察熒光時(shí)最好關(guān)掉室內(nèi)燈光，只留熒光顯微鏡光源。

8、為什么過(guò)表達(dá)慢病毒比對(duì)照的熒光要暗？

每種病毒有自己的載體容量，基因的插入會(huì)影響位于其下游的熒光蛋白等基因的表達(dá)。

對(duì)照病毒或干擾病毒，由于沒有插入基因或者插入基因非常短，熒光通常較強(qiáng)。而插入了較長(zhǎng)基因之后，熒光的亮度會(huì)隨著插入基因的長(zhǎng)度以及特殊結(jié)構(gòu)的存在等而減弱，尤其是出現(xiàn)高GC片段，由于影響了轉(zhuǎn)錄，熒光強(qiáng)度會(huì)大大降低。

其次，對(duì)照病毒相對(duì)滴度可能比對(duì)照高，同等體積的病毒，對(duì)照的病毒量大，可能對(duì)細(xì)胞的影響大。

第三，有些病毒供應(yīng)商對(duì)照和目的病毒的純化工藝可能不一致，導(dǎo)致目的或者對(duì)照病毒對(duì)細(xì)胞毒性大。

漢恒生物所有病毒同樣的純化工藝，病毒無(wú)支原體污染，質(zhì)控嚴(yán)格。

9、要曝光很長(zhǎng)時(shí)間才能觀察到熒光？

可能的原因有：

①?顯微鏡汞燈使用時(shí)間長(zhǎng)，可以通過(guò)對(duì)照病毒排除，若對(duì)照較亮可排除顯微鏡問(wèn)題；

②?pH值低，看培養(yǎng)基是否發(fā)黃，pH值較低會(huì)導(dǎo)致綠色熒光淬滅

③?目的病毒光不亮，插入目的基因后的病毒熒光強(qiáng)度會(huì)相較對(duì)照弱一些，屬于正?，F(xiàn)象，可加長(zhǎng)曝光時(shí)間。

? 漢恒生物一直致力于為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和服務(wù)，所以我們?cè)诼《竟に嚿喜粩鄡?yōu)化，在保證病毒滴度的同時(shí)，提升病毒純度，并且生產(chǎn)過(guò)程中嚴(yán)格控制，確保給客戶提供優(yōu)質(zhì)的無(wú)支原體污染的病毒。