lncRNA屬于RNA中的一種，要提取lncRNA，則需先將細(xì)胞內(nèi)的總RNA提取出，再利用RT-qPCR對所想要了解的lncRNA進行針對性的定量分析。

與提取細(xì)胞內(nèi)DNA不同的是，由于RNA極易被RNA酶（Ribonuclease, RNase）降解，所以在提取過程中需要格外注意。導(dǎo)致RNA容易降解的原因主要有三個:其一為RNA本身的結(jié)構(gòu)所決定的，與DNA不同，RNA為單鏈結(jié)構(gòu)，這決定其具有內(nèi)在不穩(wěn)定性；其二為RNase結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、且活性強；其三為RNase作為人體進化而來參與形成防御機制的防御物質(zhì)，不僅分布于體內(nèi)，也分布于人體體表以及分泌的唾液、汗液以及淚液等中，以防止外源性的RNA進入細(xì)胞內(nèi)后，翻譯出蛋白質(zhì)，給細(xì)胞帶來致命性的損傷。

為最大程度地降低RNase對RNA的降解，那么我們在實驗中的每一個步驟都應(yīng)時時刻刻想到RNase，并找出去除RNase和（或）抑制其活性的解決方法，總的來說，包括以下幾個方面：

①??? 溫度對酶活性的影響：我們都知道，在未達到最適溫度之前的一定范圍內(nèi)，酶的活性是隨溫度的升高而逐漸增強的，而RNase作為機體的一種重要酶成分，其最適溫度必定在體溫附近，因而在實驗動物體溫以下的溫度范圍內(nèi)，盡量控制低溫，可最大程度抑制酶的活性，從而減少RNase對RNA的降解，控制低溫的具體方式包括預(yù)冷所有所需的常溫保存的試劑、避免手直接接觸反應(yīng)混合液所在管壁（體溫具有一定影響）等；

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②??? 源于實驗者RNase的防護：正如上述提到的，人體分泌的唾液、汗液等均含有RNase，也就是說，在沒有較好的防護措施的條件下，即使是說句話、打個噴嚏或者是手碰到器皿，甚至僅是開蓋一段時間（空氣中也早已布滿了RNase），均有可能將RNase引入反應(yīng)液中，從而干擾實驗結(jié)果，因此，在實驗過程中，我們必須戴口罩以及手套，當(dāng)然手最好不要直接觸碰實驗器材，而最好是養(yǎng)成用干凈的鑷子鉗夾的習(xí)慣，并且在不需要加反應(yīng)試劑等操作時，將EP管閉蓋放置；

③??? 實驗器材：實驗所用器材，均必須為干凈無RNase或者是使用DEPC水(0.1%

焦磷酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）處理過的超純水，無各種離子及有機物，并可裂解破壞RNase等）理過的；

④??? 物理因素：由于RNA結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，因此，震蕩混勻時必須輕柔，以減輕物理剪切力，此外，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融、輻射以及高溫（與前者溫度對酶活性的影響不同的是，此處是指高溫可不借助RNase直接使RNA變性破壞裂解）等；

下面以TRIzol法提取小鼠心臟心肌細(xì)胞RNA為例，對此進行詳細(xì)說明：

①??? 實驗所需的離心管(Eppendorf tube， EP管) 、槍頭、鑷子、剪刀等提前一天用DEPC水浸泡，并于第二天烘干后使用，異丙醇、氯仿、75%乙醇以及無水乙醇等實驗所需常溫保存試劑均需提前數(shù)小時預(yù)冷（以下實驗中所提及的室溫靜置時間、試劑量等均可據(jù)所用試劑規(guī)格以及不同的實驗室條件等進行調(diào)整）；

②??? 無菌手術(shù)取小鼠的心臟后，加入DEPC水清洗干凈，此時可立即取部分心肌開始RNA的提取實驗（注意用無RNase鑷子夾入另一無RNase的EP管中），也可先將心肌-80℃下凍存，需要時取用；

③??? 用無RNase的槍頭，每50-100mg心肌組織中立即1mL TRIzol（冰箱4℃保存，無需預(yù)冷）；

④??? 室溫靜置15min;

⑤??? 每1ml TRIzol中加入200μl預(yù)冷的氯仿，輕柔混勻；

·氯仿的作用

氯仿一方面可使蛋白質(zhì)變性，使其沉淀（蛋白質(zhì)變性后，結(jié)構(gòu)松散，疏水鍵暴露，水溶性變差），其中包括RNase，RNase變性后，也可減少RNA的降解；另一方面氯仿作為有機溶劑，可益于苯酚、油脂等有機物雜質(zhì)的抽提去除。

⑥??? 室溫靜置10min；

⑦??? 4℃、12000轉(zhuǎn)/分（revolutions per minute, rpm）離心15min；

⑧??? 取上清至新的EP管（吸取上清時須小心，避免吸到含有RNA的上清水相層以及下層紫紅色有機層之間薄薄的白色DNA沉淀層，甚至是有機層，最終使Nanodrop 測定RNA純度時，0D260/OD280的比值偏低，吸取到DNA沉淀使該值輕微下降，吸取到有機物時該值大幅下降。在多組進行對照實驗時，可不必將上清吸取得足夠干凈，而是每個樣本均吸取等量的上清，例如每個樣本均吸取400mL的上清，也可達到控制變量以及對照的目的，這樣可減少吸取到RNA以外雜質(zhì)的目的），加入等體積預(yù)冷異丙醇混勻；

·DNA也是溶于水的，為什么DNA不會和RNA一起進入水相呢？

RNA的溶解度隨鹽濃度的變化不大，而DNA的溶解度隨鹽濃度的變化較大，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最小，而TRIzol中恰含有0.14mol/L的NaCl，且DNA也不溶于有機溶劑中，最終使DNA從水相和有機相中同時析出、在中間形成一層薄薄的白色DNA沉淀層，而RNA仍保留于水相中。

⑨??? 室溫靜置10min；

⑩??? 4℃、12000rpm離心15min；

??? 棄上清(上清一定要盡量去除干凈，減少異丙醇等有機雜質(zhì)的殘留，后續(xù)“棄上清”步驟同，其中75%乙醇還可同時去除NaCl等無機雜質(zhì)。這主要是因為高濃度乙醇是易揮發(fā)的，但其它雜質(zhì)難揮發(fā)，若不傾倒干凈，則很可能殘留于RNA沉淀中，導(dǎo)致Nanodrop 測定RNA純度時，0D260/OD230的比值偏低，但切不可用力過度，導(dǎo)致RNA沉淀甩出，前功盡棄)，加1ml預(yù)冷75%乙醇，輕柔上下顛倒使沉淀懸?。?/p>

??? 4℃、12000rpm離心5min；

??? 棄上清，加1ml預(yù)冷無水乙醇，輕柔上下顛倒使沉淀懸浮；

??? 4℃、12000rpm離心5min；

??? 棄上清，在室溫下，開蓋倒扣于干凈紙巾上晾干至半透明狀，加入適量DEPC水溶解；

??? -80℃下長期保存（數(shù)年）；逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后可于-20℃下暫時保存（數(shù)月），也可-80℃下長期保存（數(shù)年）。保存時間依提取純度不同而不同，較純凈、含RNase少的RNA密封下即使在室溫下也可保存一周左右，4℃保存一個月左右，但切忌反復(fù)凍融、開蓋，以免使RNA變性、污染。

提取出總RNA后，后續(xù)再根據(jù)需要，設(shè)計對應(yīng)引物，利用RT-qPCR方法擴增出所需研究的lncRNA即可。