寫在前面

????????今天推薦的是由法國巴斯德研究所團隊在2016年5月17日發(fā)表于Cell Reports（IF：7.985，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Oliver Bischof教授，研究表明USP1是控制基因組完整性以調(diào)控細胞衰老的關(guān)鍵因子。

研究背景

????????癌基因誘導(dǎo)的衰老（OIS）是癌前細胞轉(zhuǎn)化的有效屏障。目前關(guān)于OIS執(zhí)行功能過程中的分子通路和機制尚不清楚，但有證據(jù)顯示這一過程包括慢性DNA損傷信號和關(guān)鍵因子的翻譯后修飾。

????????去泛素化酶USP1通過介導(dǎo)IDs1-4、PCNA、FANCD2（FD2）和FANCI（FI）的去泛素化來調(diào)控它們的功能，從而在各類DNA損傷的修復(fù)事件中發(fā)揮重要作用。此外，F(xiàn)D2和FD2-Ub對衰老也至關(guān)重要。FD2-Ub在USP1基因敲除的MEF細胞中累積并可激活促衰老因子TAp63的表達。然而，這是否也發(fā)生在人類細胞中，以及FA途徑的其他組成是否參與其中，仍是一個懸而未決的問題。

摘要部分

????????在這篇文章中，作者探究了USP1及其底物在人類細胞經(jīng)歷OIS中的作用。作者發(fā)現(xiàn)，USP1的功能障礙可以誘導(dǎo)單泛素化的FANCD2異常聚集，并伴隨著慢性DNA損傷反應(yīng)和衰老的誘導(dǎo)。研究表明，USP1和單泛素化的FD2通過緩解人類細胞的復(fù)制應(yīng)激來維持增殖穩(wěn)態(tài)和基因組完整性。作者還揭示了USP1在不同細胞類型、細胞背景和物種條件下的功能差異。

研究內(nèi)容

1.USP1下調(diào)是OIS的標志??? ?

????????作者分析RNA-seq的表達譜并發(fā)現(xiàn)24個在衰老與未衰老細胞中差異表達的DUBs，其中USP3被上調(diào)而USP1被下調(diào)。考慮到USP1通過調(diào)控FD2在腫瘤發(fā)生中的潛在作用，作者進一步分析該DUB在衰老中的功能。?

????????實驗顯示，與未衰老細胞相比，衰老細胞中USP1的mRNA和蛋白水平降低。作者在兩個不同的NHF株（WI38和BJ）中穩(wěn)定沉默USP1的表達，從而誘導(dǎo)了具有衰老特征的細胞周期停滯、SABG陽性的增加以及Ki67表達的降低。這些表明USP1本身的去泛素化活性對于細胞增殖是必需的。

????????作者發(fā)現(xiàn)USP1-WT蛋白的過表達推遲了OIS的開始，與對照相比其EdU摻入量增加3.3倍。作者還發(fā)現(xiàn)過表達USP1mt蛋白的細胞其EdU摻入增加了2.4倍，這表明USP1在這種情況下可能同時發(fā)揮酶促和非酶促作用。

研究結(jié)論：USP1的下調(diào)不僅與衰老應(yīng)答相關(guān)，且可能促進衰老應(yīng)答的發(fā)生。

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2.USP1的缺失觸發(fā)p53和CDKN1A依賴的G2/M檢查點停滯??? ?

????????細胞周期分析顯示，USP1缺失的細胞處于S期的比對照組減少了1.8倍，處于G1期的減少了1.3倍，但處于G2/M期的增加了1.8倍，且多倍體細胞增加了2.5倍，這些表明USP1缺失的細胞有明顯的G2/M檢查點停滯現(xiàn)象。? ? ?

????????作者發(fā)現(xiàn)，USP1的缺失會導(dǎo)致p53在Ser15磷酸化，這是DDR（DNA損傷應(yīng)答）誘導(dǎo)p53激活的關(guān)鍵磷酸化位點。與此一致，P53的靶基因CDKN1A的表達水平也升高了。此外，作者在USP1沉默的細胞中檢測到IL1α和IL6出現(xiàn)3至4倍的上調(diào)。? ? ?

????????實驗顯示，單獨持續(xù)表達shUSP1以及與HPV16E7或野生型CDKN1A共表達的細胞迅速進入衰老狀態(tài)。相比之下，表達HPV16E6/shUSP1和CDKN1A（KO）/shUSP1的細胞可正常增殖。? ? ? ?

????????接下來，作者探究USP1的底物ID蛋白在該過程中的潛在作用。實驗表明USP1缺失且過表達ID1或ID2的細胞與僅去除USP1的對照細胞具有相同的衰老動力學(xué)。因此作者排除了ID蛋白在USP1介導(dǎo)衰老中發(fā)揮功能的可能性。

研究結(jié)論：p53及其靶基因CDKN1A是USP1缺失誘導(dǎo)衰老停滯的關(guān)鍵因子。USP1的缺失還會引起G2/M檢查點停滯和持久性DNA損傷應(yīng)答。

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3.USP1的缺失激活A(yù)TR/RAD17/CHK1依賴的DNA損傷應(yīng)答和復(fù)制應(yīng)激

????????作者將USP1與ATM、CHK2或ATR共同沉默，結(jié)果顯示，shUSP1 RNA與shATM或shCHK2共表達的細胞與僅表達shUSP1的細胞一樣進入衰老狀態(tài)。與之相反，同時沉默ATR和USP1會導(dǎo)致衰老顯著延遲。進一步的研究表明USP1缺失會誘導(dǎo)ATR激活的DNA損傷。? ? ?

????????作者在單細胞水平上通過免疫熒光分析DDR標記物的聚集。實驗數(shù)據(jù)表明USP1沉默可能導(dǎo)致復(fù)制應(yīng)激，這是ATR依賴的G2/M檢查點停滯的主要誘因。作者進一步研究了USP1在復(fù)制體動力學(xué)中的作用，并發(fā)現(xiàn)USP1的缺失導(dǎo)致復(fù)制事件比對照組增加了1.5倍，這表明了復(fù)制應(yīng)激的激活。

研究結(jié)論：USP1缺失所誘導(dǎo)的衰老與ATR-CHK1-p53-CDKN1A依賴的持續(xù)DNA損傷應(yīng)答、紊亂的復(fù)制動力學(xué)以及基因組的不穩(wěn)定性有關(guān)。

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4.USP1缺失導(dǎo)致FD2染色質(zhì)聚集、FD2依賴的檢查點激活并對絲裂霉素C敏感??? ?

????????作者首先在對照和USP1缺失的衰老細胞中檢測了FD2-Ub水平和FD2的亞核定位。實驗顯示，USP1沉默使衰老細胞中FD2-Ub的總水平顯著增加。作者還發(fā)現(xiàn)，在RAS誘導(dǎo)下，USP1缺失的衰老細胞中出現(xiàn)大量異常的FD2聚集體。這表明FD2的單泛素化會使其定位到染色質(zhì)與核基質(zhì)。? ? ?

????????與對照組相比，在完全衰老的USP1缺失細胞中沉默F(xiàn)D2導(dǎo)致?lián)饺隕dU的細胞增加了3倍。進一步的研究表明FD2是細胞增殖所必需的?？偠灾?，F(xiàn)D2/FD2-Ub、FI、CDKN1A和p53是維持USP1缺失細胞衰老的關(guān)鍵因素，且FD2-FD2Ub在復(fù)制體功能和增殖穩(wěn)態(tài)中起重要作用。? ? ?

????????作者接下來探究USP1沉默的細胞是否對DNA交聯(lián)劑MMC更敏感。實驗顯示，在10-20 ng/ml MMC的劑量范圍內(nèi)，表達shUSP1的細胞比對照細胞表現(xiàn)出2至3倍的細胞毒性。

研究結(jié)論：USP1缺失會導(dǎo)致FD2/FD2-Ub異常聚集，這有助于維持FD2/FI/p53/CDKN1A依賴的衰老，還能使永生化細胞對DNA交聯(lián)劑誘導(dǎo)的細胞死亡更為敏感。

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結(jié)論與討論

????????作者發(fā)現(xiàn), USP1的功能異常會激活慢性DNA損傷應(yīng)答，因此USP1在OIS的起始和維持中具有重要作用。研究表明, USP1是控制基因組完整性和維持細胞增殖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子，也是抗癌治療的一個潛力靶點。USP1主要通過抑制FD2蛋白在染色質(zhì)聚集、降低復(fù)制應(yīng)激以及抑制DNA損傷信號等來發(fā)揮功能。

Thank you!

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原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.04.033

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