肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌類型，死亡率高，預(yù)后差。并且轉(zhuǎn)移性HCC對治療藥物的耐藥性更強(qiáng)。原因在于，在轉(zhuǎn)移進(jìn)展過程中，癌細(xì)胞可利用脂質(zhì)為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供能量。所以，脂質(zhì)代謝重編程實際上是一個癌癥標(biāo)志，它是各種因素控制的復(fù)雜級聯(lián)反應(yīng)，而AMP活化蛋白激酶（AMPK）和乙酰輔酶a羧化酶（ACC）是其中的兩個關(guān)鍵調(diào)控因子。

環(huán)狀RNA（circRNAs）是一類內(nèi)源性RNA轉(zhuǎn)錄本，可在癌癥中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。環(huán)狀RNA也被報道在HCC中發(fā)揮作用。但目前還沒有發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA通過調(diào)控脂質(zhì)代謝來調(diào)節(jié)HCC的轉(zhuǎn)移。另外，許多在癌癥中具有確定功能的環(huán)狀RNA在人類和小鼠之間并不保守，這在某種程度上阻礙了在動物模型中環(huán)狀RNA潛在機(jī)制的深入研究。所以，鑒定在HCC中起關(guān)鍵作用的保守環(huán)狀RNA，可以對潛在生物標(biāo)志物和治療靶點的挖掘提供更有意義的參考。

2023年11月12日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)單革教授團(tuán)隊在Advanced Science(IF=15.1)發(fā)表文章"A Mammalian Conserved Circular RNA CircLARP1B Regulates Hepatocellular Carcinoma Metastasis and Lipid Metabolism"。在本研究中，一種哺乳動物保守的circRNA——circLARP1B可以在肝細(xì)胞癌（HCC）中發(fā)揮關(guān)鍵作用。circLARP1B在預(yù)后和總生存期較差的患者表達(dá)水平高，并可通過促進(jìn)HCC中脂肪酸的合成，增強(qiáng)細(xì)胞脂質(zhì)積累和癌癥轉(zhuǎn)移特性。在誘導(dǎo)的HCC模型中，敲低circLARP1B會減少癌癥轉(zhuǎn)移和脂質(zhì)積累。具體機(jī)制在于，circLARP1B與細(xì)胞質(zhì)中的異質(zhì)核糖核蛋白D（HNRNPD）結(jié)合，降低LKB1 mRNA穩(wěn)定性和蛋白水平，促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移和脂質(zhì)積累。靶向circLARP1B敲低可作為HCC治療的潛在靶點。

CircLARP1B作為一種哺乳動物保守的CircRNA，在HCC轉(zhuǎn)移中被鑒定出來

RNA-seq檢測6個HCC標(biāo)本用于研究保守環(huán)狀RNA在HCC中的功能作用。經(jīng)過一系列的分析（表達(dá)水平/保守型分析），最終鑒定出circLARP1B是表達(dá)最高，也是唯一轉(zhuǎn)移上調(diào)的circRNA，并且序列保守。circLARP1B由La核糖核蛋白1B（LARP1B）基因的外顯子2-4組成。隨后作者對circLARP1B進(jìn)行了成環(huán)/耐受/定位胞質(zhì)驗證。

NCBI和circAtlas數(shù)據(jù)庫分析的circLARP1B和LARP1B mRNA在人體組織中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式；例如，在甲狀腺組織中表達(dá)LARP1B mRNA，而不是circLARP1B。LARP1B表達(dá)量較高和較低的兩組HCC患者之間的總生存率無顯著性差異，說明LARP1B mRNA可能不是HCC的關(guān)鍵調(diào)控因子。轉(zhuǎn)移性HCC標(biāo)本中circLARP1B水平高于非轉(zhuǎn)移性標(biāo)本。并且患者的HCC標(biāo)本結(jié)果顯示，較高水平的circLARP1B與轉(zhuǎn)移的標(biāo)本和TNM晚期（III-IV）以及生存率低密切相關(guān)。綜上所述，circLARP1B作為一種哺乳動物保守的circRNA可能在HCC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進(jìn)作用。

circLARP1B介導(dǎo)脂肪酸合成調(diào)控細(xì)胞侵襲和脂質(zhì)積累

環(huán)狀外顯子的側(cè)翼內(nèi)含子分別包含Alu元素和B1重復(fù)序列，屬于反向互補序列，可以促進(jìn)環(huán)狀RNA的生物發(fā)生。為了探索circLARP1B的細(xì)胞功能，使用（CRISPR）/Cas9技術(shù)生成circLARP1B缺陷（circLARP1B-Def）PLC細(xì)胞。具體方法是，刪除了LARP1B第4個內(nèi)含子中包含4個近端Alu元件的重復(fù)序列。circLARP1B-Def PLC細(xì)胞的circLARP1B水平顯著降低，而LARP1B mRNA水平?jīng)]有變化。

Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，CircLARP1B-Def PLC細(xì)胞相對應(yīng)的侵襲能力明顯降低。不過在生長曲線和集落形成方面沒有顯著差異。侵襲能力與轉(zhuǎn)移直接相關(guān)，生長曲線和集落形成與細(xì)胞的生長和增殖有關(guān)。然后，作者通過液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）非靶向代謝組學(xué)評估了circLARP1B-Def PLC細(xì)胞中潛在的代謝改變。在6種受到顯著影響的代謝途徑中，脂質(zhì)代謝受到的干擾最大。

然后，作者進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)來檢測脂類組成，檢測到的24種失調(diào)脂類。在circLARP1B缺失下，這24種脂類發(fā)生了顯著變化，表現(xiàn)在磷脂酰乙醇胺（PE）、雙甘油酯（DG）、甘油三酯（TG）和磷脂酰肌醇（PI）降低。為了進(jìn)一步探索circLARP1B促進(jìn)脂質(zhì)積累的機(jī)制，作者用13c標(biāo)記的靶向代謝通量分析進(jìn)行了代謝標(biāo)記，以評估circLARP1B-Def和WT PLC細(xì)胞中13c標(biāo)記的葡萄糖和谷氨酰胺摻入脂質(zhì)的情況。靶向代謝通量分析結(jié)果顯示，共檢測到17種具有13C標(biāo)記的脂肪酸，發(fā)現(xiàn)它們在circLARP1B-Def細(xì)胞中均顯著降低，表明circLARP1B對脂肪酸合成（FAS）有促進(jìn)作用。葡萄糖和谷氨酰胺首先轉(zhuǎn)化為雙碳乙酰輔酶a，乙酰輔酶a作為FAS中ACC1酶的底物。Unc-51樣自噬激活激酶1（ULK1）是脂肪自噬起始的關(guān)鍵調(diào)控因子，ULK1的Ser555磷酸化誘導(dǎo)脂肪自噬。ULK1和磷酸化ULK1（p-ULK1）水平在circLARP1B-Def和WT細(xì)胞之間沒有明顯的變化。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，circLARP1B促進(jìn)了FAS的脂質(zhì)積累，而對脂肪自噬無明顯作用。

ACC1的活性被Ser79的磷酸化所抑制，觀察到在circLARP1B-Def細(xì)胞中，磷酸化的ACC1（pACC1）水平顯著上調(diào)。AMPK是催化ACC1磷酸化的主要激酶。circLARP1B-Def細(xì)胞中磷酸化的AMPK（pAMPK）水平也顯著高于WT細(xì)胞。而較高水平的pAMPK和p-ACC1會抑制circLARP1B-Def細(xì)胞的脂肪生成。AMPK的激活也會導(dǎo)致HCC中一系列代謝物的變化。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，12個circLARP1B調(diào)節(jié)的代謝物在HCC中受AMPK信號調(diào)控，其中實驗發(fā)現(xiàn)，8個代謝物在circLARP1B缺失和AMPK激活之間表現(xiàn)出一致的變化。

此外，作者還研究了circLARP1B對其他信號通路（受AMPK調(diào)控）的影響，如mTOR通路、血管生成、TGF-β和線粒體活性。與WT細(xì)胞相比，circLARP1B-Def細(xì)胞AMPK激活導(dǎo)致mTORC1磷酸化，抑制mTOR通路，抑制脂肪酸合成。這提示，circLARP1B可調(diào)控AMPK直接調(diào)控的ACC1和mTOR信號通路，從而發(fā)揮功能。

因為ACC1受AMPK直接調(diào)控，是FAS的限速酶，接下來重點研究ACC1。敲低circLARP1B可抑制細(xì)胞侵襲和脂滴形成，并增加了細(xì)胞中的p-AMPK和p-ACC1的水平。而過表達(dá)則相反。脂肪酸合成酶（FASN）是一種人脂肪生成酶，在circLARP1BDef PLC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。FASN過表達(dá)可增強(qiáng)circLARP1B-Def PLC細(xì)胞被抑制的細(xì)胞侵襲和脂滴形成能力。使用用強(qiáng)效FASN抑制劑IPI-9119處理過表達(dá)circLARP1B的PLC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)FASN抑制劑阻斷了circLARP1B對脂滴形成和細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用。綜上所述，circLARP1B可在細(xì)胞水平上重塑脂質(zhì)代謝來刺激HCC，并通過調(diào)節(jié)AMPK及其下游靶點ACC1來促進(jìn)FAS。

circLARP1B與HNRNPD蛋白相互作用

作者解析circLARP1B潛在的相互作用分子來闡明其功能機(jī)制。AGO2的RNA免疫沉淀（RIP）解析靶circRNA和miRNA的相互作用，發(fā)現(xiàn)在PLC細(xì)胞中沒有顯示circLARP1B的富集，提示circLARP1B有限的miRNA結(jié)合能力。此外，核糖體譜分析，發(fā)現(xiàn)circLARP1B與多聚體沒有明顯的結(jié)合，提示circLARP1B有限的蛋白翻譯能力。

不過作者使用生物素的探針對circLARP1B的BSJ進(jìn)行RNA下拉，跑膠分離+銀染質(zhì)譜。HNRNPD，也被稱為富含au的元素rna結(jié)合因子1（AUF1），被篩選為circLARP1的互作蛋白。隨后作者又體外再度驗證了這一結(jié)果。不過HNRNPD不結(jié)合LARP1B mRNA。

為了繪制circLARP1B中HNRNPD的結(jié)合位點，我們通過RBP map發(fā)現(xiàn)了人類和小鼠circLARP1B中保守的兩個基序（基序1和基序2），這是一種預(yù)測RNA序列中RBP結(jié)合位點的工具。這兩個位點也富au，與HNRNPD對富au區(qū)的結(jié)合偏好一致。circLARP1B中基序1或基序2的突變降低了circLARP1B和HNRNPD之間的相互作用，這而兩個基序的雙突變則直接消除了相互作用。

HNRNPD與mRNA結(jié)合可以調(diào)節(jié)RNA的穩(wěn)定性，敲低HNRNPD并不影響circLARP1B的水平，表明HNRNPD并不調(diào)節(jié)circLARP1B的穩(wěn)定性。反過來敲低circLARP1B也不影響HNRNPD mRNA和蛋白的水平。綜上所述，具有兩個功能位點的circLARP1B可以與大量的細(xì)胞質(zhì)HNRNPD相互作用，但是circLARP1B和HNRNPD不相互調(diào)節(jié)對方的表達(dá)或穩(wěn)定性。

circLARP1B結(jié)合和調(diào)節(jié)HNRNPD發(fā)揮功能作用

然后，作者開始研究HNRNPD結(jié)合在circLARP1B功能中的作用。circLARP1B過表達(dá)可以挽救circLARP1B-Def細(xì)胞被抑制的細(xì)胞侵襲和LD形成。而HNRNPD的過表達(dá)抑制了細(xì)胞侵襲和LD的形成。與HNRNPD一起過表達(dá)circLARP1B可阻斷了HNRNPD對細(xì)胞侵襲、LD形成以及p-AMPK和pACC1水平的影響。綜合這些結(jié)果提示，circLARP1B可能通過結(jié)合和調(diào)節(jié)HNRNPD發(fā)揮作用。

circLARP1B通過干擾HNRNPD降解LKB1 mRNA

為了進(jìn)一步了解circLARP1B和HNRNPD在HCC細(xì)胞中的分子機(jī)制，作者進(jìn)行HNRNPD RIP，對RIP的RNA進(jìn)行RNA-seq。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mRNA靶標(biāo)上的分布主要顯示在3‘UTR，這與細(xì)胞質(zhì)HNRNPD通過與3’UTR結(jié)合調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性的功能作用一致。將來自circLARP1B-Def細(xì)胞和circLARP1B過表達(dá)細(xì)胞的RIP-seq數(shù)據(jù)與來自相應(yīng)的對照細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)受circLARP1B水平變化影響的mRNA子集可能在競爭HNRNPD時存在劣勢，因為其與該蛋白的結(jié)合能力相對較弱（圖5a）。

對這些靶基因的基因本體論（GO）發(fā)現(xiàn)，Thr磷酸化最顯著（P值最低），其中LKB1也被稱為絲氨酸/蘇氨酸激酶11（STK11）在3‘UTR上顯示出最全面的HNRNPD結(jié)合信號。眾所周知，LKB1可以直接催化AMPK的Thr172的磷酸化，而這是AMPK激活所必需的。RIP-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，circLARP1B缺失會促進(jìn)HNRNPD結(jié)合LKB1，而circLARP1B過表達(dá)則相反。但circLARP1B過表達(dá)，HNRNPD結(jié)合circLARP1B多，反之則反。過表達(dá)的LKB1阻斷了circLARP1B促進(jìn)細(xì)胞侵襲和LDs形成的作用，也幾乎消除了circLARP1B對p-AMPK和pACC1水平的影響。與非轉(zhuǎn)移性HCC標(biāo)本相比，轉(zhuǎn)移性HCC標(biāo)本中的LKB1蛋白水平較低。這些結(jié)果表明，LKB1 mRNA是circLARP1B的下游靶點，二者的功能作用相反。

circLARP1B減少，LKB1 mRNA的穩(wěn)定水平增加。那HNRNPD和circLARP1B互作是否調(diào)控LKB1 mRNA的穩(wěn)定水平呢？實驗結(jié)果表明，敲低HNRNPD會導(dǎo)致細(xì)胞中LKB1 mRNA的半衰期和LKB1蛋白水平顯著降低，表明HNRNPD正向調(diào)控LKB1 mRNA穩(wěn)定。而在circLARP1B敲低卻能增加LKB1 mRNA的穩(wěn)定性和蛋白水平，過表達(dá)則相反。綜上，circLARP1B雖然不影響HNRNPD表達(dá)，但會抑制LKB1表達(dá)，具體機(jī)制在于circLARP1B可以阻斷HNRNPD對LKB1基因穩(wěn)定的促進(jìn)作用。

circLARP1B降低可抑制HCC進(jìn)展

作者使用CRISPR/Cas9生成circLARP1B缺陷小鼠（circLARP1B?/?），誘導(dǎo)小鼠肝臟中circLARP1B的表達(dá)顯著降低，而Larp1b mRNA和蛋白水平不變。通過油紅O染色檢測發(fā)現(xiàn)，circLARP1B敲低小鼠肝臟中的ld顯著降低，而p-Ampk和p-Acc1的蛋白水平顯著升高。

為了在機(jī)體水平上檢測circLARP1B在HCC中的生理作用，作者使用二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)小鼠HCC，DEN已被證實會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟損傷并最終導(dǎo)致肝癌發(fā)生。在DEN誘導(dǎo)18周后（HCC小鼠），與WT小鼠相比，circLARP1B?/?小鼠的肝臟腫瘤淋巴結(jié)表現(xiàn)出更少、更小，肺轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)明顯更小，抗轉(zhuǎn)移標(biāo)志物e-鈣粘蛋白升高。在circLARP1B?/?HCC小鼠中，與HCC相關(guān)的生物標(biāo)志物均有降低。綜上所述，敲低circLARP1B水平能夠抑制HCC的進(jìn)展、脂質(zhì)積累和轉(zhuǎn)移。

LKB1是circLARP1B在HCC中發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點

敲低circLARP1B抑制HCC進(jìn)程已有定論。circLARP1B?/?HCC小鼠模型顯示，敲低Lkb1可以誘發(fā)HCC，表現(xiàn)為促進(jìn)肝腫瘤增生和肺淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及Vim水平增高，e-鈣粘蛋白升高降低，情況和WT的HCC小鼠一樣。circLARP1B?/?HCC小鼠肝臟中觀察到的p-Ampk和p-pAcc1水平的升高，Lkb1敲低后也被降低。這提示，Lkb1作為關(guān)鍵因子參與肝細(xì)胞中circLARP1B介導(dǎo)HCC脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)移過程。

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https://doi.org/10.1002/advs.202305902