免疫沉淀系列實驗之抗體你選對了嗎？
免疫沉淀（IP）及相關(guān)的實驗技術(shù)Co-IP、ChIP、RIP都會涉及到對抗體的使用，包括免疫沉淀和WB檢測這兩個步驟。有的同學(xué)可能就會想到既然都是針對同一個蛋白的抗體，是不是意味著免疫沉淀和WB的抗體可以通用呢？首先明確的是科研工作中有節(jié)儉意識是好事，但是不能因此而盲目做了無用功，反而造成了浪費。那么這兩種實驗的抗體到底能不能通用呢？IP、Co-IP、ChIP、RIP之間抗體的選擇又有什么需要注意呢？本期咱們重點聊聊這些實驗的抗體選擇問題。
?????? 整體來說，我們需要了解目的蛋白的特性、抗體的特點以及免疫沉淀技術(shù)的原理等，綜合多方面信息來選擇合適的抗體。就此，小恒總結(jié)了以下幾點需要考慮的地方：
（1）蛋白的特性
?? ① 了解目的蛋白的結(jié)構(gòu)和修飾方式，與抗體的免疫原性序列進(jìn)行比對，查看是否能與目的蛋白結(jié)合；如果是一些具有特殊表型的蛋白，更是要比對免疫原性序列，看是否能發(fā)生交叉反應(yīng)。
?? ② 外源性表達(dá)的截短型或其他突變型重組蛋白，則需要注意抗體的免疫原區(qū)是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)；這種情況通常是探討蛋白互作位點要關(guān)注的，可能會出現(xiàn)截短區(qū)正好包括所用抗體的識別表位，重組蛋白就無法被檢測到；如果重組蛋白無法找到合適的抗體，可以添加蛋白標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，進(jìn)而可選擇標(biāo)簽抗體做檢測，即可解決此問題。
（2）抗體的種屬特異性
?? 不同物種中的同一種蛋白之間可能會存在著一些差異，比如氨基酸構(gòu)成、蛋白結(jié)構(gòu)及大小，因此需要了解抗體說明書上標(biāo)注的可反應(yīng)種屬有哪些。通常來說，大部分商業(yè)化抗體是以人源蛋白為模板設(shè)計的，結(jié)合不同物種同源性蛋白的情況，可用于其他物種進(jìn)行交叉反應(yīng)，最常見的是小鼠和大鼠。
（3）實驗方法的特點
?????? 不同實驗方法對蛋白的處理方式不同，例如Elisa、IP、WB、IHC、ICC或是FACS，提取和處理蛋白樣本時是否會變性、空間構(gòu)象的改變等，因此對于抗體所能識別的抗原表位和效價也有著不一樣的要求。
（4）單克隆抗體（單抗）還是多克隆抗體（多抗）
?????? 使用單抗還是多抗，也要仔細(xì)考慮后決定。目前市面上的抗體一般以多抗為主，單抗和多抗在使用上都各有優(yōu)缺點。單抗特異性強(qiáng)，背景低，但親和力相對小，檢測靈敏度會相應(yīng)低些，識別位點單一；而多抗的親和力較好，靈敏度高，但是特異性較差，容易出現(xiàn)非特異性結(jié)合的情況，導(dǎo)致背景偏高。
對于WB和免疫沉淀所用的抗體有什么區(qū)別？IP、Co-IP、ChIP、RIP的抗體能通用嗎？下面繼續(xù)看看這兩個問題。
（1）WB和免疫沉淀實驗的抗體需求差異
免疫沉淀系列實驗技術(shù)能真實反映活細(xì)胞中蛋白的互作關(guān)系，也就是說蛋白的天然構(gòu)象得以保留，做免疫沉淀的抗體就需要是能夠識別蛋白表面結(jié)構(gòu)的，若抗體識別表位藏在蛋白三級結(jié)構(gòu)內(nèi)部則不適用，所以必須使用IP級別的抗體，這種抗體通常是用純化的天然蛋白或重組蛋白來制作的。WB處理蛋白時會進(jìn)行加熱變性為線性結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)內(nèi)部的位點得以呈現(xiàn)，這種通常是使用人工合成的多肽制作抗體，以識別蛋白的線性結(jié)構(gòu)且特異性很強(qiáng)。所以WB和IP的抗體不一定能夠通用，需要具體問題具體分析，同時進(jìn)行實驗驗證才能下定論，或者是直接參考文獻(xiàn)，用別人驗證過有效的、大廠的抗體。
（2）IP、Co-IP、ChIP、RIP之間的抗體也有區(qū)別？
?????? 一般來說，如果某一抗體可用于IP，則說明可能也可以用于Co-IP、RIP；雖然和ChIP也沒有太大區(qū)別，但是ChIP級別的抗體在純度和特異性上都要求較高，且DNA與蛋白進(jìn)行交聯(lián)，若交聯(lián)后蛋白的結(jié)合部位正好是抗體識別表位，就會導(dǎo)致抗體無法識別，導(dǎo)致實驗失敗。這種情況則需要更換其他抗體，且最好是經(jīng)過ChIP實驗驗證的抗體，以確保實驗的成功率。另外也要特別注意，即使是通用抗體，其不同實驗的使用濃度可能也是不同的，實驗前一定要細(xì)讀抗體使用說明，讓實驗更順利地開展。
（3）實在沒有ChIP級別的抗體，怎么辦呢？
?????? 經(jīng)ChIP驗證過的抗體數(shù)量確實非常有限，那么可以考慮從其他角度入手進(jìn)行嘗試：
① 嘗試使用IP、IHC或ICC的抗體，這些抗體一般是識別蛋白的天然構(gòu)象，與ChIP類似；
② 比較不同物種蛋白間的同源性，蛋白同源性超過80%可嘗試跨物種使用抗體；
③ 目的蛋白融合蛋白標(biāo)簽，外源性表達(dá)重組蛋白，以標(biāo)簽蛋白為靶標(biāo)做ChIP。
漢恒生物專注病毒包裝十余年，有豐富的實戰(zhàn)經(jīng)驗，有多種蛋白標(biāo)簽可供選擇，以滿足不同實驗對標(biāo)簽使用的需求，如有產(chǎn)品需求或技術(shù)問題，歡迎聯(lián)系咨詢~
