認(rèn)識(shí)裸鼠

裸鼠，又名無(wú)胸腺裸鼠。它是先天性胸腺缺陷、由于第VIII連鎖群內(nèi)裸體位點(diǎn)基因發(fā)生純合而形成的突變小鼠。

裸鼠是由于nu基因有獨(dú)特的遺傳特性，成為科學(xué)研究中具有巨大潛力的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?jīng)過(guò)世界各國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳育種學(xué)家的努力，已將nu基因?qū)氩煌幌祫?dòng)物，成為系列動(dòng)物模型，僅小鼠模型一種，已建立了二十余種近交系裸鼠。

本文將重點(diǎn)介紹裸鼠的成瘤實(shí)驗(yàn)方法。

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常見(jiàn)成瘤細(xì)胞

常規(guī)較容易成瘤的細(xì)胞：Hep-G2（肝癌），Hep2（喉癌），NCI-H460(大細(xì)胞肺癌)， A431(表皮癌)，SK-OV-3（卵巢癌），MCF-7（乳腺癌）SKBR3， A375/B16-F10（人黑色素瘤細(xì)胞），SGC7901 人胃腫瘤細(xì)胞 ?，KB人口腔表皮樣癌細(xì)胞

可以成瘤但是比較慢的細(xì)胞：CNE（鼻咽癌），A549（肺癌）， SPC-A-1（肺腺癌）， HT-29（結(jié)腸癌），BEL-7402（肝癌），MDA-MB-231 乳腺癌 ?， CT26 （小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞 ），SH-SY5Y (人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 ) ， U251 （人膠質(zhì)瘤細(xì)胞） ， BGC-823（人胃癌細(xì)胞） ?，PC-3 （人前列腺癌細(xì)胞）

一些比較有爭(zhēng)議的細(xì)胞：Hela（宮頸癌），HCT（人回盲腸癌細(xì)胞/人結(jié)直腸癌腺癌細(xì)胞）。其他：BMSC（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）

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操作流程（以Hep-G2細(xì)胞為例）

01準(zhǔn)備對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的、細(xì)胞密度達(dá)80-90%左右的Hep-G2細(xì)胞，于收集細(xì)胞前一天晚上更換新鮮培養(yǎng)基。

02胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓未脫離培養(yǎng)皿時(shí)，去除胰酶，加入無(wú)血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，離心清洗一次，重懸至終濃度為8×10^7個(gè)細(xì)胞/mL。

03將細(xì)胞懸液和高濃度基質(zhì)膠在4℃環(huán)境下按1:1比例進(jìn)行稀釋，制備成終濃度為4×10^7個(gè)細(xì)胞/mL。

04左手抓取固定裸鼠，于裸鼠左側(cè)腋窩處皮下注射，接種時(shí)，針頭在皮下進(jìn)針深一點(diǎn)，約1cm深，以減少注射后細(xì)胞懸液從針眼溢出，接種體積為100μL。(這一過(guò)程盡量在半小時(shí)內(nèi)完成，途中細(xì)胞懸液放在冰上以減緩細(xì)胞凋亡及防止出現(xiàn)凝膠現(xiàn)象。）

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05將裸鼠放回籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)，大約1周左右可看到腫瘤出現(xiàn)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在腫瘤體積不超過(guò)1000mm3前對(duì)裸鼠進(jìn)行安樂(lè)死，取出腫瘤，拍照。

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要點(diǎn)分析

1.細(xì)胞的狀態(tài)是成瘤實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，所以細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)一定要好，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)80-90%左右密度為宜，收集細(xì)胞前一天晚上更換新鮮培養(yǎng)基。

2.胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS洗兩遍去除殘余血清(含多種抗原)

3.用PBS或基礎(chǔ)培基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，由于細(xì)胞濃度較大，建議另取EP管稀釋10倍后計(jì)數(shù)

4.計(jì)數(shù)后稀釋至合適濃度，一般打1-5x10^6細(xì)胞/只，倫理要求不超過(guò)1x10^7/只，每只老鼠注射體積一般是100-200ul，如果細(xì)胞不易成瘤可添加基質(zhì)膠(細(xì)胞懸液:基質(zhì)膠=1: 1)

5.稀釋好的細(xì)胞懸液放冰上，使細(xì)胞處于比較低的代謝狀態(tài)，由于細(xì)胞濃度高，每打一只都要用槍吹勻，避免細(xì)胞成團(tuán)造成濃度不均，從而造成組內(nèi)差異過(guò)大

6.一般選擇5-6周齡裸鼠，小于4周可能不耐受過(guò)早死亡，大于6周免疫力會(huì)增強(qiáng)，不易成瘤

7.接種部位:選擇血管豐富且易操作的部位接種，如腋下、腹股溝、側(cè)腹部及頸背部等部位，其中腋下中后部皮下較好，成瘤率高，比較推薦打腋下，一人操作很方便，后續(xù)量瘤子也很好操作

8.進(jìn)針時(shí)先用針頭刺破皮膚，持平注射器使針頭在皮下行進(jìn)一段距離(約0.5-1cm深)后開(kāi)始注射，注射前針頭稍微動(dòng)一動(dòng)，能動(dòng)說(shuō)明在皮下，否則可能在皮內(nèi)或者肌肉內(nèi)

9.注射過(guò)程不能太快，注射完畢后緩慢拔出針頭，用棉簽或棉球輕壓進(jìn)針孔避免細(xì)胞液流出(建議用胰島素針，比較細(xì)不容易漏)

10.一般7-10天后可見(jiàn)腫瘤出現(xiàn)，一般每隔2-3天測(cè)量一次腫瘤大小，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)和最短部位，V=1/2*a*b2(為長(zhǎng)軸b為短軸)

11.腫瘤生長(zhǎng)不宜過(guò)大，一般直徑不超過(guò)15mm，體積不超過(guò)2000mm3

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常見(jiàn)問(wèn)題及解答

1.這個(gè)實(shí)驗(yàn)為什么用裸鼠而不用普通的老鼠或者小白鼠？

裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)用的裸鼠，最大的特點(diǎn)是沒(méi)有胸腺等免疫器官，它的免疫力幾乎為零，對(duì)腫瘤細(xì)胞沒(méi)有免疫作用，易于成瘤。

2.瘤塊為什么長(zhǎng)起來(lái)又消失？

腫瘤塊先縮小，后變大很常見(jiàn)，很可能是炎癥反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞被小鼠自身吸收，繼續(xù)觀察腫瘤細(xì)胞吸收之后是否經(jīng)過(guò)幾周還能長(zhǎng)出來(lái)，長(zhǎng)不起來(lái)建議換鼠。

3.是否可以在一只小鼠進(jìn)行多個(gè)點(diǎn)接種？

不可以，一只老鼠就只能接種一個(gè)點(diǎn)，因?yàn)橐粋€(gè)老鼠身上有多個(gè)腫瘤塊的情況下，可能會(huì)相互影響。

40腫瘤長(zhǎng)不出來(lái)是怎么回事？

第一：腫瘤生長(zhǎng)周期很慢，一周開(kāi)始生長(zhǎng)腫塊，大約需要1~2個(gè)月才能長(zhǎng)成腫瘤；

第二：可能是細(xì)胞狀態(tài)差，活力不好，或是腫瘤細(xì)胞不易成瘤，需加入基質(zhì)膠輔助或增大接種量或更換細(xì)胞系；

第三：一方面可能是小鼠周齡太大，或小鼠免疫排斥，建議更換免疫缺陷程度更大的小鼠（Nod-scid小鼠）。

5.腫瘤體積相差很大，大小不一？

首先，并不是所有的腫瘤都能夠長(zhǎng)得均一形態(tài)。其次，這可能跟小鼠周齡及接種細(xì)胞量不一致導(dǎo)致，建議重新接種。