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益生菌可以產(chǎn)生有益的維生素、消化酶、必需氨基酸、免疫調(diào)節(jié)和抗菌代謝產(chǎn)物，從而促進(jìn)人體健康，預(yù)防腸道炎癥性疾病、自身免疫性疾病和胃腸道感染。其寶貴特性已得到健康行業(yè)、醫(yī)療專業(yè)人士和公眾的認(rèn)可。

比起單菌株益生菌，多菌株益生菌在改善腸道微生物群穩(wěn)定性和宿主健康更具優(yōu)勢。然而，總的來說，尚不清楚不同菌株會(huì)在多大程度上合作或競爭資源，以及共同生物膜微環(huán)境的建立如何影響它們的相互作用。需要新的方法來設(shè)計(jì)合成益生菌聯(lián)合體，以克服單一菌株配方的局限性。

羅伊氏乳桿菌Lactobacillus reuteri?和 布拉酵母菌Saccharomyces boulardii是兩種重要的益生菌。

羅伊氏乳桿菌L. reuteri是一種革蘭氏陽性桿菌，可以抑制病原微生物的定植并改善宿主共生微生物群組成的平衡，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可以加強(qiáng)腸道屏障功能。關(guān)于羅伊氏乳桿菌詳見：認(rèn)識(shí)羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)

布拉酵母菌S. boulardii是一種對(duì)胃環(huán)境有抵抗力并在低 pH 條件下具有良好生存能力的酵母。它帶來腸道屏障功能的改善、病原體競爭排斥、抗菌肽的產(chǎn)生、免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng)效應(yīng)。

本文介紹和驗(yàn)證了一個(gè)系統(tǒng)的方法來描述微生物在多種生長條件下的相互作用，該方法將共培養(yǎng)分析與代謝的基因組規(guī)模建模和多變量數(shù)據(jù)分析相結(jié)合，并將其應(yīng)用于L. reuteri?和?S. boulardii這兩種益生菌之間的相互作用，表征它們產(chǎn)生有益于人類健康的化合物的潛力。

結(jié)果表明，這些菌株可以建立一種混合的合作-拮抗相互作用，最好的解釋是爭奪共享資源，個(gè)體交換增加，但氨基酸和短鏈脂肪酸的凈產(chǎn)量通常減少。

方?法

整個(gè)試驗(yàn)方法主要分為三個(gè)部分：

• 微生物培養(yǎng)與生化測定實(shí)驗(yàn)

• 基因組尺度代謝模型重建

• 對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析

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▼?Part.1??微生物培養(yǎng)與生化測定實(shí)驗(yàn)

使用的菌株分別是

• Lactobacillus reuteri DSM20016(DSMZ，德國)

• Saccharomyces boulardii(Swiss Bioenergetics，瑞士)

同時(shí)準(zhǔn)備兩種不同的培養(yǎng)基用于微生物培養(yǎng)，分別為tryptone soya broth(TSB)培養(yǎng)基和含0.4%葡萄糖的M9最小培養(yǎng)基。

為了測試菌株在不同生長條件下對(duì)生態(tài)相互作用(單一培養(yǎng)或混合培養(yǎng))的影響，同時(shí)制作了含有10ml(浮游培養(yǎng)物)或2ml(生物膜培養(yǎng)物)的培養(yǎng)液。

根據(jù)光密度、CFU數(shù)量和一組相關(guān)代謝物的濃度，對(duì)每個(gè)培養(yǎng)物進(jìn)行長期監(jiān)測。

生化測定使用生化檢測試劑盒分別測定培養(yǎng)基中的代謝物，葡萄糖、甘油、琥珀酸鹽、乙酸鹽、乙醇、短鏈脂肪酸、L-氨基酸和氨水平。

▼?Part.?2?基因組規(guī)模模型重建

將觀察到的代謝活動(dòng)擴(kuò)展到基因組規(guī)模，對(duì)兩例菌株及微生物群和生物膜發(fā)展采用了專用的建模策略。

代表混合培養(yǎng)的微生物群落基因組尺度代謝模型（簡稱，GSMM模型）是通過 COBRA 工具箱中的 createMultipleSpeciesModel 函數(shù)創(chuàng)建的。

結(jié)果是創(chuàng)建了一個(gè)共同的細(xì)胞外隔間，其中單個(gè)GSMMs被封裝，并與環(huán)境共享邊界代謝物交換，有效的模擬了交叉喂養(yǎng)和營養(yǎng)競爭。而為了模擬再現(xiàn)實(shí)驗(yàn)觀察到的菌株在不同生長模式下的代謝活動(dòng)，引入了群落生物量偽反應(yīng)，定義如下:

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μ LR和μ SB表示通過L. reuteri和S. boulardii的單個(gè)生物質(zhì)假反應(yīng)的通量。

文章中為L. reuteri菌株自動(dòng)化構(gòu)建了一個(gè)新GSMM模型。新生成的模型包含了精選模型中54%的反應(yīng)和69%的代謝物，幾乎將反應(yīng)數(shù)量增加了一倍，引入的43%的代謝物只有2.4%的通量不一致反應(yīng)。

對(duì)于S. boulardii菌株，使用的是現(xiàn)有的iMM904模型，這是一個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證的釀酒酵母GSMM模型。

為了全面了解每種條件下的代謝潛能，使用通量采樣充分探索可實(shí)現(xiàn)的代謝狀態(tài)。

▼?Part.?3?多元統(tǒng)計(jì)分析

使用Matlab R2017b和R3.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，主要有PCA、PLSCA和聚類分析。

結(jié)果

★?1.??L.reuteri和S. boulardii的生態(tài)相互作用

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觀察在單一培養(yǎng)和混合培養(yǎng)下分別以浮游模式和生物膜模式生長時(shí)的干重動(dòng)態(tài)，如下圖：

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結(jié)果表示：

◆?S. boulardi菌株在6h時(shí)浮游模式生長得更快更好

◆?L. reuteri菌株在48h時(shí)形成了更好的生物膜

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當(dāng)菌種一起生長時(shí)，兩個(gè)菌株最終時(shí)間點(diǎn)的CFU濃度發(fā)生了顯著變化，如下圖：

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結(jié)果表示：

◆?L. reuteri?的浮游生長模式在混合培養(yǎng)中急劇下降

◆?S. boulardi?的浮游生長則受到了積極的影響

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分析兩種菌株生長模式的潛在機(jī)制

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結(jié)果表示：

◆?S. boulardi?是共生長的受益者

◆?L. reuteri?受到抑制

例如：S. boulardi?可能受益于L. reuteri?菌株產(chǎn)生的糖，同時(shí)?L. reuteri?可能會(huì)受到?S. boulardi菌株生長代謝的傷害。

例如：S. boulardi?生長耦合離子交換或有機(jī)酸的產(chǎn)生可能引發(fā)環(huán)境pH值降低，這可能在多個(gè)功能水平上影響?L. reuteri?的代謝。

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在代謝水平上也觀察到單一培養(yǎng)和混合培養(yǎng)之間存在的一些差異，如下圖：

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例如，M9混合培養(yǎng)6h的氨消耗量是相應(yīng)的單一培養(yǎng)的近7倍。

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還有，在浮游和生物膜混合培養(yǎng)中，乙酸和琥珀酸的形成大約多兩倍。統(tǒng)計(jì)值如圖D所示。

★?2.?評(píng)估多菌株群落的基因組代謝潛力

上述生化數(shù)據(jù)表明，在乳酸菌-酵母組合中，乙酸鹽和琥珀酸鹽的產(chǎn)量增加，但試劑盒所能測的代謝物畢竟有限。

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為了全面估計(jì)未直接測量的代謝潛能，采用了如方法所述的基因組建模。

圖A 分別為使用實(shí)驗(yàn)測量數(shù)據(jù)和基于計(jì)算機(jī)建模預(yù)測生成的數(shù)據(jù)的PCA分析結(jié)果， 與實(shí)驗(yàn)測量結(jié)果表現(xiàn)一致，只是在建模產(chǎn)生的數(shù)據(jù)中更加放大了復(fù)雜培養(yǎng)基中的共培養(yǎng)物與各自的單一培養(yǎng)物之間的鴻溝。研究人員因此有理由假設(shè)，在廣泛的水平上，這種模式也發(fā)生在體外。

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圖B 觀察到不同條件導(dǎo)致的各代謝物的產(chǎn)出和消耗變化，如模型預(yù)測了S. boulardi的生物素分泌，當(dāng)使用最小培養(yǎng)基時(shí)，生物素分泌在生物膜模式下減少，而在復(fù)雜培養(yǎng)基中增加。類似地，多菌株環(huán)境與最小培養(yǎng)基中生物素產(chǎn)量的減少有關(guān)，而在復(fù)雜培養(yǎng)基中觀察到相反的趨勢。

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為了評(píng)估模型預(yù)測的可信度，同時(shí)再現(xiàn)上述結(jié)果，研究人員測量了不同條件下的總氨基酸分泌率，如下圖顯示：

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盡管模型通量相對(duì)于實(shí)驗(yàn)值些許膨脹，但趨勢是一致的，特別是與?S. boulardi?菌株相比，混合培養(yǎng)中總氨基酸產(chǎn)量的下降。因此，在所有條件下，S. boulardi?產(chǎn)生氨基酸的速率最高，但生物膜也與這種速率的大幅降低有關(guān)。

★?3.?推斷菌株對(duì)不同生長條件的特異性反應(yīng)

圖A應(yīng)用PLSCA分析，重點(diǎn)研究了菌株水平的代謝交換率與包括菌株、培養(yǎng)基、培養(yǎng)類型和生長方式在內(nèi)的因素集之間的關(guān)系。

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可以觀察到菌株和培養(yǎng)基類型是對(duì)生長歸一化代謝物交換影響最大的參數(shù)，因?yàn)樗鼈兾挥诰嚯x原點(diǎn)最遠(yuǎn)的地方。

隨著作用強(qiáng)度的降低，培養(yǎng)類型(單一培養(yǎng)或共培養(yǎng))和生長方式(生物膜、浮游)也隨之改變。其中，培養(yǎng)類型的影響比生長模式更強(qiáng)，這突出表明兩個(gè)物種之間的生態(tài)相互作用對(duì)它們的代謝物產(chǎn)生有顯著影響。

圖B展示了與實(shí)驗(yàn)因素相關(guān)的交換機(jī)制，以及與之高度相關(guān)的代謝物。

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下圖展示了在單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)下，各代謝物歸一化后的增長率差異，以更好地評(píng)估群落建立的影響，并做出更詳細(xì)的互動(dòng)機(jī)制假設(shè)。

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可以看到，當(dāng)在增長率歸一化時(shí)，許多健康相關(guān)化合物與單一培養(yǎng)相比，在共培養(yǎng)中產(chǎn)生得更多。盡管總氨基酸產(chǎn)量下降，但當(dāng)微生物在一起生長時(shí)，這些氨基酸實(shí)際上可能會(huì)進(jìn)行大量的交換。

結(jié)?論

這是一個(gè)綜合實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)建模方法來探究生長方式（生物膜vs浮游生長）對(duì)生態(tài)相互作用（單一培養(yǎng)vs混合培養(yǎng)）的影響的研究。

研究發(fā)現(xiàn)，特定微生物代謝物的產(chǎn)生會(huì)受到生長模式、生長培養(yǎng)基的組成、微生物種類及其在共培養(yǎng)中的相互作用的顯著影響。

研究人員表示通過文中提出的計(jì)算方法，可以設(shè)計(jì)新的益生菌產(chǎn)品，并為代謝工程方法的應(yīng)用提供科學(xué)見解，以優(yōu)化所需有益代謝物的生產(chǎn)。

這可以提高某些益生菌產(chǎn)品的生物學(xué)和商業(yè)價(jià)值，直接造福于益生菌行業(yè)，臨床上也有可能為與腸道菌群相關(guān)的疾病制定更好的治療方案，如炎癥性腸病、肥胖、2型糖尿病、心血管疾病、自身免疫和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

參考文獻(xiàn)：

Zampieri G, Efthimiou G, Angione C. Multi-dimensional experimental and computational exploration of metabolism pinpoints complex probiotic interactions. Metab Eng. 2023 Jan 28;76:120-132. doi: 10.1016/j.ymben.2023.01.008. Epub ahead of print. PMID: 36720400.