近年來，各種抗體庫(kù)技術(shù)的發(fā)展使得制備針對(duì)特定靶標(biāo)的重組工程抗體的技術(shù)已經(jīng)千差萬別。但如何從多種類型的抗體生產(chǎn)細(xì)胞，如小鼠的雜交瘤細(xì)胞、人的B細(xì)胞等抗體生產(chǎn)細(xì)胞中克隆正確的目標(biāo)抗體V區(qū)基因或是抗體結(jié)合位點(diǎn)的基因片段，仍然是研究者開展基因工程抗體研究所面臨的第一個(gè)問題。經(jīng)過多年的發(fā)展完善之后，研究者們已經(jīng)建立了一套很有效的基于PCR的技術(shù)路線和方法，來從各類抗體生產(chǎn)細(xì)胞中克隆單一或者混合的抗體V區(qū)基因。 在Morrison等人發(fā)明最早的基因工程抗體——人-鼠嵌合抗體時(shí)，他們僅采用了來自基因組序列的小鼠V區(qū)基因片段進(jìn)行重組，構(gòu)建嵌合抗體基因。隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)和普及、應(yīng)用，研究者發(fā)現(xiàn)使用小鼠V區(qū)基因cDNA基因片段進(jìn)行重組構(gòu)建更為便捷有效。對(duì)于從生產(chǎn)單一抗體的細(xì)胞如小鼠雜交瘤細(xì)胞中克隆V區(qū)基因cDNA基因片段，目前研究者普遍采用的方法是RT-PCR法，先反轉(zhuǎn)錄制備細(xì)胞的cDNA，或相應(yīng)抗體基因的DNA，然后利用經(jīng)過精心設(shè)計(jì)的套裝引物，采用PCR的方法從中特異擴(kuò)增目標(biāo)抗體的輕重鏈V區(qū)基因片段，分離這些PCR擴(kuò)增片段，常規(guī)克隆入相應(yīng)載體之后，采用測(cè)序、測(cè)定結(jié)合活性等手段鑒定所克隆獲得的抗體輕重鏈V區(qū)基因。上述過程通常所有的操作均可以按照標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆程序進(jìn)行。 在采用RT-PCR法克隆抗體輕重鏈V區(qū)基因的過程中最關(guān)鍵的是設(shè)計(jì)用于PCR特異擴(kuò)增抗體V區(qū)基因的套裝引物。雖然對(duì)于每一種單克隆抗體來說其V區(qū)基因兩端的序列都有可能是不同的，但經(jīng)過多年的研究積累，目前人們對(duì)于各種抗體V區(qū)基因兩端序列的變化規(guī)律已經(jīng)有了深入的認(rèn)識(shí)，同種類型的單克隆抗體V區(qū)基因的兩側(cè)序列具有很高的同源性。通過使用多個(gè)同源性高的兩端序列，并結(jié)合簡(jiǎn)并堿基的引物設(shè)計(jì)方案，研究者已經(jīng)設(shè)計(jì)出大量的V區(qū)基因PCR擴(kuò)增套裝引物，它們多數(shù)在實(shí)際應(yīng)用中都能有效地?cái)U(kuò)增，獲得目標(biāo)抗體的V區(qū)基因cDNA片段。當(dāng)遇到某套裝引物不能奏效時(shí)，仍然可以嘗試其他套裝引物直至獲得合適的擴(kuò)增片段。 在采用RT-PCR法克隆抗體輕重鏈V區(qū)基因時(shí)仍然有一些問題是需要我們高度重視并小心處理的。首要需要注意的是，雜交瘤等抗體生產(chǎn)細(xì)胞往往是不穩(wěn)定的，抗體基因的突變和丟失將可能隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變得越來越嚴(yán)重，導(dǎo)致克隆獲得錯(cuò)誤的抗體V區(qū)基因，甚至根本無法擴(kuò)增克隆出V區(qū)基因。因此，獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤克隆，或在克隆V區(qū)基因之前進(jìn)行適當(dāng)?shù)膩喛寺〔僮?，保證所提取的細(xì)胞DNA均含有正有標(biāo)抗體V區(qū)基因，確保最終能克隆獲得正確的抗體V區(qū)基因。另外，擴(kuò)增用的簡(jiǎn)并套裝引物雖然為PCR擴(kuò)增的成功提供了保障，這種引物設(shè)計(jì)的方式以及包括PCR擴(kuò)增過程本身，都有可能為抗體V區(qū)基因的克隆帶來突變的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致克隆的抗體V區(qū)與抗原結(jié)合的特性發(fā)生顯著的改變。對(duì)多個(gè)所獲得的抗體V區(qū)基因克隆測(cè)序可以排除PCR擴(kuò)增過程本身所帶來的突變。這些突變可能多數(shù)不起作用，但有時(shí)也能顯著影響抗體結(jié)位點(diǎn)與抗原結(jié)合的特性。為了確保測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，可對(duì)所獲抗體V區(qū)是否能正確地與抗原結(jié)合進(jìn)行適當(dāng)?shù)蔫b定。 即便是分泌單一單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中也同時(shí)具有多個(gè)完整的抗體基因，有時(shí)我們還會(huì)碰到同時(shí)克隆出多個(gè)具有正確的抗體V區(qū)基因特征的基因片段，這時(shí)分別鑒定其表達(dá)的抗體的結(jié)合功能是我們確定正確的目標(biāo)抗體V區(qū)基因的唯一辦法。 德泰生物自建雜交瘤測(cè)序平臺(tái)，基于RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技術(shù)和Failsafe?假基因排除技術(shù)，能夠提供快速、可靠的雜交瘤抗體基因測(cè)序服務(wù)http://www.detaibio.com/hybridoma-antibody-sequencing-service.html。可對(duì)抗體的可變區(qū)或全長(zhǎng)進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)序，測(cè)序范圍涵蓋小鼠、大鼠、兔、山羊等物種。同時(shí)，德泰生物還擁有成熟的抗體表達(dá)平臺(tái)，可以將獲得的抗體基因進(jìn)行表達(dá)、純化、驗(yàn)證，測(cè)序表達(dá)快至1周。