退火溫度與Tm值

①在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。

②引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)

③Tm對于設(shè)定pcr退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。

④引物退火溫度：退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量;溫度高特異性強(qiáng)，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降;溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37℃反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的最適退火溫度。也可根據(jù)引物的(G+C)%含量進(jìn)行推測，把握試驗(yàn)的起始點(diǎn)，一般試驗(yàn)中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴(kuò)增引物的融解溫度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式進(jìn)行計(jì)算：Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃

其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個(gè)數(shù)。例如，20個(gè)堿基的引物，如果(G+C)%含量為50%時(shí)，則Ta的起點(diǎn)可設(shè)在55℃。在典型的引物濃度時(shí)(如0.2μmol/L),退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長時(shí)間退火沒有必要。

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