因慢病毒載體能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，如造血干細(xì)胞和T細(xì)胞，在細(xì)胞和基因治療中的應(yīng)用越來越廣泛。目前cGMP級慢病毒載體的大規(guī)模生產(chǎn)受到使用的HEK293T細(xì)胞的黏附性和血清依賴性的限制。

2020年6月，圣猶達(dá)兒童研究醫(yī)院載體開發(fā)和生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室的Robert E. Throm研究員帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)在Molecular Therapy - Methods & Clinical Development期刊上發(fā)表了題為“Production of Lentiviral Vectors Using Suspension Cells Grown in Serum-free Media”的文章。文章中報(bào)道，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新的生產(chǎn)方案，通過使用市購和化學(xué)定義的無血清培養(yǎng)基，使HEK293T細(xì)胞在懸浮中生長。利用優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件，將質(zhì)粒DNA的需要量減少了50%，從懸浮細(xì)胞中產(chǎn)生了滴度相當(dāng)于HEK293T細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)的慢病毒載體。

一、獲得SJ293TS細(xì)胞系

為了將貼壁HEK293T細(xì)胞系馴化為懸浮生長細(xì)胞系，研究團(tuán)隊(duì)使用了市售的Freestyle 293?(Thermo Fisher Scientific)?無血清培養(yǎng)基，采用Freestyle 293?+ 10%?FBS的培養(yǎng)基代替DMEM + 10%?FBS的293T標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并將細(xì)胞分別培養(yǎng)至未組織培養(yǎng)處理培養(yǎng)皿和組織培養(yǎng)處理培養(yǎng)皿上。研究團(tuán)隊(duì)以1周為間隔減少培養(yǎng)基中的血清量，每周傳代3次。4周后，細(xì)胞在僅有Freestyle 293存在的情況下懸浮生長。直接在未組織培養(yǎng)處理的培養(yǎng)皿上馴化的細(xì)胞比在組織培養(yǎng)處理的培養(yǎng)皿上馴化得到的細(xì)胞聚團(tuán)少，這兩種方法最終都成功地使HEK293T細(xì)胞在Freestyle 293中懸浮生長。最后將馴化得到的細(xì)胞系命名為SJ293TS，然后在震動(dòng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，8%?二氧化碳，125 rpm)，形成主細(xì)胞庫。復(fù)蘇細(xì)胞，以在5e5cells?/mL密度進(jìn)行培養(yǎng)，每24小時(shí)計(jì)數(shù)一次，培養(yǎng)2天。結(jié)果表明，SJ293TS細(xì)胞每23.4±2.7h倍增，細(xì)胞密度達(dá)到3e6cells?/mL，且細(xì)胞活率未受影響。SJ293TS細(xì)胞系的后期培養(yǎng)將保持在3e5- 3e6 cells?/mL之間，每2-3天傳代一次。

二、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法的優(yōu)化

圖1.?SJ293TS細(xì)胞制備慢病毒載體的轉(zhuǎn)染優(yōu)化* * * p = 0.0002, p = 0.0167, * * * p = 0.0053, p = 0.0193 * * * *，n = 3。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

研究團(tuán)隊(duì)使用一個(gè)表達(dá)GFP的慢病毒來優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件(vector CL40-MND-GFP)，并以20mL體系培養(yǎng)在125ml搖瓶中以便檢測。首先，研究團(tuán)隊(duì)測試了轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度的影響情況?；贖EK293T細(xì)胞慢病毒包裝進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度約為1e6 cells?/?mL的經(jīng)驗(yàn)，將轉(zhuǎn)染SJ293TS細(xì)胞時(shí)的密度控制在0.5 - 3e6 cells?/?mL，采用兩種不同的量添加轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA，每1e6?cells?采用0.55和1.1?μg?DNA。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，離心棄上清，將細(xì)胞重懸于20ml新鮮培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集上清液，并使用HOS細(xì)胞進(jìn)行滴度測定。如圖1所示，使用以0.55?μg?DNA /?每1e6 cells?轉(zhuǎn)染的SJ293TS細(xì)胞的慢病毒產(chǎn)量受到接種密度的顯著影響，其中接種密度為2e6 cells/mL的慢病毒滴度最高。

接下來，團(tuán)隊(duì)研究了聚乙烯亞胺(PEI)和質(zhì)粒DNA之間形成最佳多聚體的時(shí)間。制作單個(gè)主轉(zhuǎn)染混合物并孵育30分鐘。在不同的時(shí)間點(diǎn)，從轉(zhuǎn)染混合物中取樣，用于轉(zhuǎn)染SJ293TS細(xì)胞，生產(chǎn)慢病毒并檢測滴度。雖然未從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中觀察搭配顯著差異，但孵育5分鐘后進(jìn)行慢病毒包裝而生產(chǎn)得到的慢病毒滴度達(dá)到最大值，且孵育時(shí)間較長則傾向于降低滴度。因此，SJ293TS細(xì)胞的所有后續(xù)轉(zhuǎn)染均在PEI與質(zhì)粒DNA孵育5min后進(jìn)行。

三、SJ293TS細(xì)胞與其他細(xì)胞基于HEK293的細(xì)胞系生產(chǎn)慢病毒的比較

表1. HEK293T或SJ293TS細(xì)胞生產(chǎn)的慢病毒載體的滴度

為了評估SJ293TS細(xì)胞系在懸浮系統(tǒng)的中的慢病毒產(chǎn)量，研究團(tuán)隊(duì)比較了在5L搖瓶中SJ293TS的慢病毒產(chǎn)量與在10層細(xì)胞工廠系統(tǒng)中的親本HEK293T細(xì)胞的慢病毒產(chǎn)量(均為1L)。為了進(jìn)行比較，各制備了三種不同的臨床相關(guān)慢病毒：兩種是含有帶有熒光的針對人BCL11A的shRNA-miR（SJL118和SJL121），另一種含有第二代抗CD19嵌合抗原受體的慢病毒（αCD19-CAR），如表1所示，HEK293T-10層細(xì)胞工廠系統(tǒng)生產(chǎn)的慢病毒滴度分別比SJ293TS-5L搖瓶系統(tǒng)生產(chǎn)的慢病毒高1.8倍、1.4倍和2倍。

圖2.?SJ293TS、病毒產(chǎn)生細(xì)胞(VPCs)和Expi293F作為慢病毒載體產(chǎn)生細(xì)胞系的比較從SJ293TS、病毒生產(chǎn)細(xì)胞(VPCs)或Expi293F細(xì)胞中生產(chǎn)pCL40-MND-GFP(黑色)或pCL30-V5m3-Sardinia(灰色)，規(guī)模為20 mL。*p = 0.0252，?**p = 0.0239。N = 3。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

接下來，研究團(tuán)隊(duì)將SJ293TS細(xì)胞系與市售的兩種基于HEK293的懸浮細(xì)胞系進(jìn)行了比較，即Expi293F細(xì)胞和病毒產(chǎn)生細(xì)胞。三種細(xì)胞系以20mL的體系進(jìn)行慢病毒包裝以生產(chǎn)慢病毒（CL40-MND-GFP）。除了GFP-LV外，還比較了一種更復(fù)雜的慢病毒生產(chǎn)，即表達(dá)人類g-珠蛋白基因的V5m3-Sardinia。如圖2所示，兩種慢病毒的滴度結(jié)果表明，SJ293TS細(xì)胞系生產(chǎn)的慢病毒的滴度是病毒產(chǎn)生細(xì)胞或Expi293F細(xì)胞的10至25倍。

四、SJ293TS細(xì)胞慢病毒生產(chǎn)方法的改進(jìn)

為了提高SJ293TS細(xì)胞系用于cGMP級慢病毒生產(chǎn)的產(chǎn)量和適用性，研究團(tuán)隊(duì)對其慢病毒生產(chǎn)工藝進(jìn)行了優(yōu)化。研究團(tuán)隊(duì)使用RNA-OUT技術(shù)制備質(zhì)粒以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的以抗生素篩選來制備質(zhì)粒。使用RNA-OUT取代了輔助物上的β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)，并轉(zhuǎn)移了質(zhì)粒，這有助于減少質(zhì)粒骨架的大小。該團(tuán)隊(duì)還通過用等體積的新鮮培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染細(xì)胞來減少轉(zhuǎn)染后的額外操作。

研究團(tuán)隊(duì)還通過優(yōu)化用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SJ293TS細(xì)胞的質(zhì)粒比例來提高慢病毒的產(chǎn)量。結(jié)果表明，與前期使用的12:6:2:0.25的質(zhì)粒比例相比，目的質(zhì)粒:HIV-1?gagpol:Env:HIV-1?rev的比例為14:4:2:0.25時(shí)，得到的表達(dá)第二代抗CD123嵌合抗原受體慢病毒（SJL644）滴度增加了1.7倍。使用每皮克HIV-1 p24含1e4個(gè)物理粒子來計(jì)算，每TU的物理粒子從平均319個(gè)顯著減少到170個(gè)（p=0.0071）。因此，新的質(zhì)粒比例被用于后續(xù)SJ293TS系統(tǒng)的慢病毒生產(chǎn)。

圖3. SJ293TS細(xì)胞持續(xù)高滴度生產(chǎn)臨床相關(guān)慢病毒載體及與HEK293T細(xì)胞衍生滴度1-L的比較(A)連續(xù)傳代4個(gè)月以上的SJ293TS細(xì)胞周期性生產(chǎn)VSV-G假型SJL643的未處理上清液(灰色實(shí)線帶圓圈)和純化后的慢病毒載體制劑(黑色虛線帶三角形)的滴度。(B)從1 L轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞或SJ293TS細(xì)胞中獲得的總慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TUs)。*p = 0.02554。HEK293T細(xì)胞n = 3, SJ293TS細(xì)胞n = 6。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

通過連續(xù)傳代SJ293TS細(xì)胞4個(gè)月，使用另一種表達(dá)第二代抗CD123嵌合抗原受體的臨床慢病毒（SJL643）進(jìn)行周期性1-L?慢病毒生產(chǎn)，評估了SJ293TS慢病毒生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。如圖3A所示，結(jié)果表明慢病毒原液與純化液的滴度具有高度可重復(fù)性，平均值分別為5.3±1.9e7和1.2±0.4e9TUs/mL。如圖3B所示，與在HEK293T細(xì)胞-10層細(xì)胞工廠系統(tǒng)中使用氨芐青霉素抗性質(zhì)粒生產(chǎn)相同的慢病毒做比較時(shí)，從SJ293TS系統(tǒng)中獲得慢病毒的滴度高1.8倍，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p=0.002554。

五、SJ293TS細(xì)胞慢病毒的下游工藝

圖4. SJ293TS慢病毒載體生產(chǎn)圖

SJ293TS細(xì)胞慢病毒的下游工藝如圖4所示，在慢病毒生產(chǎn)過程中，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將全能核酸酶添加到生產(chǎn)體系中，以減少上清液中的質(zhì)粒和基因組DNA。收獲慢病毒上清后，使用按比例縮小的cGMP級工藝純化由SJ293TS系統(tǒng)生產(chǎn)的1L?慢病毒樣品，對其進(jìn)行澄清化處理，繼而進(jìn)行陰離子交換色譜、切向流濃縮過濾和0.22?μM過濾，以減少終產(chǎn)品中宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的污染，提高慢病毒終產(chǎn)品中TU的濃度，并確保最終產(chǎn)品的無菌性。研究者將這些處理方法應(yīng)用于該機(jī)構(gòu)的1-L研究級慢病毒制劑生產(chǎn)純化（n=138）。0.22?μM過濾后，慢病毒TU的平均總回收率為原液中總TU的55%?±?14%。與團(tuán)隊(duì)前期使用HEK293T細(xì)胞-10層細(xì)胞工廠系統(tǒng)進(jìn)行慢病毒生產(chǎn)純化得到的樣品相比，產(chǎn)量提升了2倍。

表2.?轉(zhuǎn)導(dǎo)后第4天和第7天的HOS細(xì)胞載體拷貝數(shù)

研究者對四種不同的1-L?慢病毒樣品（純化前后）進(jìn)行ddPCR分析，以檢測是否存在質(zhì)粒污染。結(jié)果如表2所示，盡管在所有測試的樣品中都檢測到了質(zhì)粒DNA，但收獲時(shí)上清液中的質(zhì)?？截悢?shù)比轉(zhuǎn)染時(shí)添加的質(zhì)粒減少了3-4 logs（p=0.001），且純化前后沒有顯著變化（p>0.05）。這些數(shù)據(jù)表明，在慢病毒生產(chǎn)過程中用相對較低數(shù)量的全能核酸酶處理慢病毒收獲液能顯著降低樣品中的質(zhì)粒殘留量。且殘留的質(zhì)粒DNA不太可能影響慢病毒的滴度結(jié)果。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，研究者對用非濃縮或濃縮慢病毒制劑轉(zhuǎn)導(dǎo)的HOS細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行了ddPCR。在第4天和第7天收獲的HOS細(xì)胞中，ddPCR均未檢測到質(zhì)粒信號。

六、SJ293TS源性LV在臨床基因和細(xì)胞治療中的適用性

圖5. SJ293TS慢病毒載體高效轉(zhuǎn)導(dǎo)健康人T細(xì)胞。用SJ293TS細(xì)胞制備的四種不同的慢病毒載體(由兩種不同的抗cd123 -?car慢病毒載體組成)在MOI為25時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)來自單個(gè)健康供體的CD4+和CD8+人T細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后7天，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD123 CAR的表達(dá)(A);同時(shí)測定細(xì)胞總數(shù)、活率(B)和載體拷貝數(shù)(C)。

在該研究團(tuán)隊(duì)的工藝開發(fā)過程中，已經(jīng)生產(chǎn)了臨床相關(guān)的慢病毒，因此便想測試這些慢病毒如何轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞群，主要是人T細(xì)胞或CD34+陽性HSC。如圖5所示，SJ293TS細(xì)胞系生產(chǎn)的慢病毒能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)健康供體來源的人T細(xì)胞。使用含有兩種不同的第二代抗CD123-CAR慢病毒以及pSJL605和pSJL643的四種不同的慢病毒以25的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人T細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后7天，所有四個(gè)T細(xì)胞群在表面表達(dá)高水平的抗CD123CAR，并保持與未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相當(dāng)?shù)臄U(kuò)增水平和活力（圖5A和5B）。四個(gè)不同慢病毒批次之間每個(gè)細(xì)胞的平均VCN非常一致，證明了SJ293TS生產(chǎn)系統(tǒng)的的可重復(fù)性（圖5C）。

接下來，研究者測試了已知對VSV-G假型慢病毒具有耐藥性的人CD34+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。與原代T細(xì)胞的結(jié)果類似，產(chǎn)自SJ293TS生產(chǎn)系統(tǒng)的LV有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)了從不同健康供體獲得的外周血的人CD34+細(xì)胞。為了證實(shí)一批特定的慢病毒不會(huì)產(chǎn)生有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)，研究者生產(chǎn)了兩種不同的慢病毒，每一個(gè)都表達(dá)一個(gè)shRNA和一個(gè)來自人血紅蛋白基因座控制區(qū)DNA超敏位點(diǎn)HS2和HS3的熒光團(tuán)，以及b-球蛋白啟動(dòng)子（SJL425）和具有BCL11A增強(qiáng)子的人糖蛋白A啟動(dòng)子（SJL319）。以50的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+細(xì)胞，隨后將其接種到MethoCult中，以評估來自造血譜系細(xì)胞的VCN。12天后，將MethoCult菌落匯集在一起，并通過ddPCR測定平均VCN。SJL425在兩個(gè)不同的供體身上獲得了0.89和2.71的VCN；SJL319的兩種單獨(dú)制劑在第三個(gè)供體上顯示出0.76和1.05的VCN。數(shù)據(jù)有限，但在使用SJL425慢病毒的MethoCult培養(yǎng)物中觀察到的近3倍的VCN差異可能反映了供體允許性的差異。

七、BaEV-R-less假型慢病毒

圖6. SJ293TS和HEK293T細(xì)胞產(chǎn)生的總BaEV - R -less偽型慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。當(dāng)使用等量的轉(zhuǎn)染DNA時(shí)，SJ293TS細(xì)胞產(chǎn)生的TUs比HEK293T細(xì)胞多20倍。*p = 0.0054。N = 4。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

另一種包膜糖蛋白，狒狒內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（BaEV），已被證明可以極大地改善人B細(xì)胞對VSV-G假型慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)抗性。但這種包膜蛋白的使用存在局限性，貼壁HEK293T細(xì)胞在BaEV假型慢病毒生產(chǎn)過程中形成合胞體，導(dǎo)致生產(chǎn)得到的慢病毒滴度低。研究團(tuán)隊(duì)推斷，BaEV假型慢病毒在懸浮系統(tǒng)中生產(chǎn)可能會(huì)減少細(xì)胞合胞體的形成，并增加BaEV假型慢病毒滴度。為了檢驗(yàn)SJ293TS細(xì)胞是否可以提高BaEV-R-less假型慢病毒的產(chǎn)生量，團(tuán)隊(duì)比較了HEK293T和SJ293TS生產(chǎn)的表達(dá)GFP的慢病毒(CL40-MND-GFP)的滴度。其中轉(zhuǎn)染SJ293TS和HEK293T細(xì)胞的體系分別為20 mL和10 mL。由于SJ293TS細(xì)胞轉(zhuǎn)染的DNA濃度是HEK293T細(xì)胞的一半，因此轉(zhuǎn)染到每個(gè)細(xì)胞系中的DNA總量是相同的。如圖6所示，使用相同量的轉(zhuǎn)染DNA，SJ293TS細(xì)胞生產(chǎn)的慢病毒的TU是HEK293T細(xì)胞生產(chǎn)的慢病毒的20倍。此外，從SJ293TS細(xì)胞以1L規(guī)模生產(chǎn)三種不同的BaEV-R-less假型慢病毒，并通過使用第五章所述的下游處理濃縮50倍。根據(jù)慢病毒的不同，終產(chǎn)品的滴度在0.2到2e8TUs/mL之間，總流程平均總得率為33%±2.9%。這些數(shù)據(jù)表明，SJ293TS可用于生產(chǎn)滴度高于貼壁HEK293T細(xì)胞的BaEV-R-less假型慢病毒，并可使用離子交換和切向流過濾進(jìn)行純化。

總結(jié)：慢病毒用于臨床的一個(gè)關(guān)鍵考慮因素是其轉(zhuǎn)導(dǎo)臨床相關(guān)靶細(xì)胞的能力。SJ293TS細(xì)胞來源的慢病毒能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員的志愿者外周血和健康供者來源的外周血T細(xì)胞來源的CD34 +細(xì)胞。以上數(shù)據(jù)表明，SJ293TS生產(chǎn)系統(tǒng)代表了慢病毒生產(chǎn)的重大進(jìn)步，因?yàn)樗€(wěn)定，不需要?jiǎng)游镅苌噭?，并且適合真正的大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)提高了慢病毒的產(chǎn)量和純化效率。研究團(tuán)隊(duì)在未來會(huì)將工作主要集中在通過使用5?L規(guī)模的攪拌槽生物反應(yīng)器進(jìn)行SJ293TS生產(chǎn)系統(tǒng)的放大試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：Bauler, Matthew , et al. "Production of Lentiviral Vectors Using Suspension Cells Grown in Serum-Free Media." Molecular Therapy — Methods & Clinical Development 17(2019).
DOI:?https://doi.org/10.1016/j.omtm.2019.11.011.

來源：“榮谷生物”公眾號，作者-melody 。
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