這種競(jìng)爭性ELISA試劑盒用于測(cè)定生物樣品中的14,15-DHET水平的特異性ELISA已經(jīng)發(fā)表。14,15-DHET水平與高血壓、腦組織嚙齒類動(dòng)物的損傷和中風(fēng)。14,15-DHET是可溶性環(huán)氧化物水解酶介導(dǎo)的代表性代謝產(chǎn)物EET的代謝，其由細(xì)胞色素P450的花生四烯酸環(huán)氧合酶活性產(chǎn)生。人類使用14，15-DHET ELISA試劑盒測(cè)量血液14，15-DHET水平。增加14,15-DHET水平通過14，15-DHET ELISA檢測(cè)到的人細(xì)胞表明癌細(xì)胞。

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本試劑盒可用于測(cè)定血清、血漿、細(xì)胞和組織中的14,15-DHET分離和純化。以下幾頁提供了關(guān)于正確隔離和純化的說明。這種競(jìng)爭性ELISA試劑盒，基于14,15-DHET表位和14,15-DH ET-HRP綴合物之間的競(jìng)爭對(duì)于可從抗14，15-DHET抗體獲得的有限數(shù)量的結(jié)合位點(diǎn)，其被涂布到96孔ELISA板。共軛物濃度在每個(gè)孔中保持恒定，而14，15-DHET是可變的，基于樣品或標(biāo)準(zhǔn)物的濃度。因此，14,15的數(shù)量-能夠與每個(gè)孔結(jié)合的DHET綴合物與14，15的濃度成反比-標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的DHET。結(jié)合到每個(gè)孔的綴合物的量然后由當(dāng)添加TMB時(shí)所獲得的顏色的量。TMB與井中可用的HRP反應(yīng)。使用加入硫酸，藍(lán)色的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為黃色的產(chǎn)物，可以在450納米的平板讀數(shù)器。

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14，15-DHET是可溶性環(huán)氧化物水解酶（sEH）介導(dǎo)的EET代謝的代表性代謝產(chǎn)物，由細(xì)胞色素P450（CYPs）2C和2J的花生四烯酸環(huán)氧合酶活性產(chǎn)生。這種競(jìng)爭具有HRP系統(tǒng)的ELISA試劑盒已用于測(cè)定生物樣品（組織，血漿和尿液）和細(xì)胞培養(yǎng)基。使用艾美捷14,15-DHET Hypertension ELISA#DH1，已發(fā)現(xiàn)強(qiáng)正相關(guān)發(fā)現(xiàn)高血壓、腦損傷和中風(fēng)患者的14,15-DHET水平，轉(zhuǎn)移性腦脊髓炎患者的EET水平癌細(xì)胞表型和胰島素抵抗。下一代高血壓藥物的發(fā)現(xiàn)在幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。96孔板的每個(gè)試劑盒適用于頂多24個(gè)樣品的一式三份分析。

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儲(chǔ)存和穩(wěn)定性：

如果所有組件在使用前都儲(chǔ)存在適當(dāng)?shù)臏囟认?，該套件將獲得較佳效果。項(xiàng)目應(yīng)在收到此試劑盒后在指定溫度下儲(chǔ)存。所有成分都儲(chǔ)存在-20°C以下，不應(yīng)過度冷凍和解凍。

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注意事項(xiàng)：

? 在開始分析之前，請(qǐng)仔細(xì)閱讀所有說明。

? 該試劑盒中的試劑經(jīng)過測(cè)試和配制，以達(dá)到極佳效果。此套件可能不起作用如果更換了任何試劑或修改了任何程序，則正確。

? 本試劑盒僅供研究使用，不得用于診斷。

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程序性說明：

? 移除所有需要的試劑，包括TMB，并使其平衡至室溫在進(jìn)行測(cè)定之前。

? 有必要將濃縮的緩沖溶液充分混合。每個(gè)緩沖液中包含一個(gè)攪拌棒解決方案

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樣品制備：

根據(jù)14,15-DHET所處的介質(zhì)，有不同的分離和純化方案。下面列出了不同的協(xié)議。為了獲得較好的結(jié)果，遵循基于生物學(xué)的適當(dāng)方案樣品存在：

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14,15-DHET在細(xì)胞中的測(cè)量

1.使用含有終濃度約0.1 mM TPP（三苯基膦，0.03-0.05 mg/mL）的溶液收集并勻漿和/或超聲處理細(xì)胞。TPP是一種抗氧化劑，看起來像沉淀在樣品中，因?yàn)樗蝗菀兹芙狻Ｔ谑褂煤蠺PP的儲(chǔ)存樣品之前，旋轉(zhuǎn)樣品以從樣品溶液中分離沉淀的TPP。

2.用乙酸將整個(gè)均化的細(xì)胞酸化至約3-4的pH。測(cè)量使用標(biāo)準(zhǔn)pH紙。

3.用乙酸乙酯萃取。向均質(zhì)細(xì)胞中加入等體積的乙酸乙酯渦流非常好。離心后，將上層有機(jī)相放入新鮮干凈的試管中。然后添加將另一等體積的乙酸乙酯加入均化細(xì)胞中，開始第二次提取。強(qiáng)烈建議進(jìn)行三次提取

4.從提取物中蒸發(fā)合并的乙酸乙酯，直到所有乙酸乙酯都在氬氣或氮?dú)庀赂稍铩?/p>

5.皂化（如需要）（見下文）

6.向20μL乙醇或N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中加入10μL，以重組上述步驟#4的干燥殘留物。加入0.5 mL 1x樣品稀釋緩沖液（試劑盒中提供）。在ELISA平板上，每孔加載100μL，一式三份。（注意：我們建議測(cè)量不同的稀釋度樣本，試圖將結(jié)果擬合到標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如，添加3個(gè)孔，其中50μL為樣品加50μL 1x樣品稀釋緩沖液，3孔，其余樣品加90μL，10μL1x樣品稀釋緩沖液。）

7.進(jìn)行14,15-DHET的ELISA（根據(jù)制造商的說明）

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皂化作用（從甘油骨架上裂解脂肪酸）：

1.將干燥的脂肪酸（從3X乙酸乙酯提取物中獲得）溶解在2 mL 20%KOH溶液中（制作工作溶液：1 mL 2 M KOH+4 mL甲醇，使KOH的最終濃度=0.4 N）。

2.渦旋并在50°C下孵育1小時(shí)。

3.向溶液中加入1.5 X H2O，并用20%甲酸將pH調(diào)節(jié)至pH~5。

4.用乙酸乙酯（1份水溶液+1份乙酸乙酯）重新提取溶液并干燥。

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14,15-DHET在組織中的測(cè)量

1.將1g組織、4mL H2O和0.01mg TPP均勻化。

2.通過向每個(gè)勻漿中加入8μL乙酸來酸化勻漿。

3.用等量的乙酸乙酯提取，徹底渦旋，向下旋轉(zhuǎn)，收集有機(jī)物階段再重復(fù)兩次提取，將所有有機(jī)相合并。

4.用氬氣或氮?dú)飧稍镉袡C(jī)相。

5.皂化（如果需要）（參見細(xì)胞中的14,15-DHET測(cè)量）

6.用乙醇或DMF溶解來自上述步驟#4的干燥殘留物。（添加約20μL乙醇或DMF以重新構(gòu)成干燥的殘留物。）

7.用1x樣品稀釋緩沖液進(jìn)一步稀釋：加入約0.5 mL 1x樣品稀釋劑緩沖并在室溫下以10000rpm離心5分鐘。上清液將用于ELISA。

8.進(jìn)行14,15-DHET的ELISA（根據(jù)制造商的說明）。

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化驗(yàn)準(zhǔn)備：

提供了固體96孔板和TMB溶液，以便隨時(shí)使用。其他化驗(yàn)試劑的制劑為詳細(xì)內(nèi)容如下。

洗滌緩沖液：將溶液混合，用小火加熱，直到得到透明無色的溶液。稀釋整個(gè)用225毫升去離子水洗滌緩沖濃縮物（25毫升）的含量，得到250毫升的最終體積1倍洗滌緩沖液。然后可以在試劑盒的整個(gè)使用壽命內(nèi)對(duì)其進(jìn)行冷藏。

HRP綴合物：用12.00 mL的1X HRP緩沖液稀釋1小瓶14,15-DHET-HRP綴合物（0.012 mL）。一個(gè)小瓶就足以制成一個(gè)盤子的共軛物。共軛物必須在同一天使用，不應(yīng)儲(chǔ)存以備日后使用。

標(biāo)準(zhǔn)：將5根微管標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)1至標(biāo)準(zhǔn)5。稀釋樣品稀釋液的全部內(nèi)容儲(chǔ)備緩沖液（25 mL）和225 mL去離子水，得到最終體積為250 mL的1倍樣品稀釋液緩沖器將0.9 mL樣品稀釋緩沖液加入標(biāo)準(zhǔn)品1至5的微管中。降速封閉

14,15-DHET標(biāo)準(zhǔn)小瓶（2μL，填充惰性氣體），加入1.998 mL樣品稀釋緩沖液，獲得2 mL解決方案。給本標(biāo)準(zhǔn)貼上標(biāo)簽6。將0.1mL標(biāo)準(zhǔn)品6添加到標(biāo)有標(biāo)準(zhǔn)品5的微管中并混合非常接下來，將0.1mL標(biāo)準(zhǔn)品5加入標(biāo)有標(biāo)準(zhǔn)品4的微管中，并充分混合。繼續(xù)到使用1:10稀釋液對(duì)其余標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行連續(xù)稀釋。

樣品：如果樣品在溶液中，可以直接稀釋到1倍樣品稀釋緩沖液中。用于提取和干燥的樣品，建議用最少量的N，N二甲基甲酰胺乙醇（DMF，10μL至20μL）溶解干燥的樣品并充分渦旋。ELISA測(cè)定前，加入100μL的1 X樣品稀釋緩沖液，使儲(chǔ)備樣品溶液準(zhǔn)備好用ELISA進(jìn)行定量。庫存樣品溶液可以進(jìn)一步稀釋到用于ELISA測(cè)試的適當(dāng)濃度范圍。