隨著納米二氧化鈦材料 (nTiO2)在各種工業(yè)產(chǎn)品中的廣泛生產(chǎn)和使用，人們?nèi)找骊P(guān)切其對(duì)環(huán)境造成的潛在的生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，nTiO2在紫外照射下產(chǎn)生的活性氧對(duì)微生物產(chǎn)生不利的生物效應(yīng)，但也有報(bào)道指出，在黑暗中長期接觸nTiO2可誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞壁增厚和生物膜形成，促進(jìn)微生物適應(yīng)環(huán)境。因此，nTiO2對(duì)微生物造成何種影響，需要深入而細(xì)致的探討。

2022年3月，來自湘潭大學(xué)的張鵬研究團(tuán)隊(duì)在Journal of Hazardous Materials?（IF 14.224）上發(fā)表題為”Quantitative proteomics and phosphoproteomics elucidate the molecular mechanism of nanostructured TiO2-stimulated biofilm formation”的文章，該研究整合蛋白質(zhì)組學(xué)與磷酸化修飾組學(xué)探討微生物適應(yīng)納米材料的分子機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，nTiO2顯著改變活性污泥中菌群結(jié)構(gòu)，其中大腸桿菌可通過形成生物膜適應(yīng)亞致死的nTiO2。中科新生命為其提供了蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化修飾組學(xué)技術(shù)服務(wù)。

研究材料

nTiO2，Escherichia coli?K12

技術(shù)路線
步驟1：nTiO2選擇性富集細(xì)菌病原體并增加微生物群落的多樣性；
步驟2：nTiO2脅迫下大腸桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)及磷酸化修飾組學(xué)分析；
步驟3：nTiO2通過增強(qiáng)鐵的吸收促進(jìn)生物膜的生成；
步驟4：nTiO2通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程提高大腸桿菌對(duì)抗菌劑適應(yīng)性；
步驟5：nTiO2通過CsgD的去磷酸化增加了生物膜的生成。

研究結(jié)果

1. nTiO2選擇性富集細(xì)菌病原體并增加微生物群落的多樣性

研究人員向活性污泥中分別添加0、5、50 mg/L nTiO2，30h后觀察脅迫條件下生物膜的生長情況。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，生物膜生物量逐漸增加，并且暴露于nTiO2的活性污泥具有更高的細(xì)菌豐度和群落多樣性。尤其是一些條件致病菌豐度顯著增加，如腸桿菌屬、乳球菌屬等?？傊?，nTiO2暴露顯著改變了活性污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了生物膜的形成。

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2. nTiO2脅迫下大腸桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)及磷酸化修飾組學(xué)分析

為了解析nTiO2促進(jìn)生物膜形成的機(jī)制，研究選取大腸桿菌分析了nTiO2暴露引起的蛋白表達(dá)及磷酸化修飾層面的變化。蛋白質(zhì)組學(xué)及磷酸化修飾組分別鑒定到2937個(gè)蛋白和350個(gè)磷酸化肽段和741個(gè)修飾位點(diǎn)。GO和KEGG分析顯示，上調(diào)表達(dá)的蛋白中顯著富集鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和維持鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)通路，以及核糖體蛋白和RNA聚合酶亞基蛋白。這些結(jié)果表明，nTiO2脅迫影響了細(xì)菌對(duì)鐵元素的利用，增強(qiáng)了RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯過程，可能影響細(xì)菌對(duì)轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成抑制類抗生素的耐藥性。

3. ?nTiO2通過增強(qiáng)鐵的吸收促進(jìn)生物膜的形成

通過對(duì)暴露于50mg/L nTiO2下的大腸桿菌生物膜進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)鐵元素有高親和力的大腸桿菌素合成蛋白以及鐵元素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)上調(diào)明顯，研究者猜測nTiO2促進(jìn)細(xì)菌對(duì)鐵的利用來增強(qiáng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。因此，研究人員利用三價(jià)鐵螯合物來驗(yàn)證鐵元素對(duì)nTiO2脅迫下生物膜生長的影響。實(shí)驗(yàn)表明，外源鐵螯合劑干擾了細(xì)菌對(duì)鐵的吸收，破壞了生物膜的發(fā)育，這進(jìn)一步證明了nTiO2通過增強(qiáng)鐵的吸收促進(jìn)生物膜的生成。

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?4. nTiO2通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程提高大腸桿菌對(duì)抗菌劑適應(yīng)性

為了深入探究大腸桿菌是否通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯過程來響應(yīng)nTiO2脅迫，研究人員在細(xì)菌培養(yǎng)基中添加不同類型的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成抑制劑，分析nTiO2對(duì)大腸桿菌適應(yīng)性的影響。結(jié)果顯示，蛋白合成抑制劑四環(huán)素處理下的nTiO2暴露組生物膜含量與對(duì)照組相當(dāng)，表明蛋白質(zhì)合成過程并未參與調(diào)控大腸桿菌對(duì)nTiO2脅迫下的適應(yīng)性。而轉(zhuǎn)錄抑制劑利福平處理下nTiO2暴露組生物膜含量顯著高于對(duì)照組，表明nTiO2通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程增加大腸桿菌的適應(yīng)性。nTiO2處理導(dǎo)致利福平的靶標(biāo)蛋白R(shí)poB磷酸化修飾顯著下調(diào)，這一調(diào)控是nTiO2提高大腸桿菌對(duì)轉(zhuǎn)錄抑制劑耐藥性的主要機(jī)制。

?5. nTiO2通過CsgD的去磷酸化增加了生物膜的生成

CsgD是已報(bào)道的調(diào)控大腸桿菌生物膜形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，調(diào)控胞外多糖、菌毛和纖維素的合成，而纖維素作為線性多糖聚合物，是生物膜形成的重要保護(hù)支架。本研究組學(xué)結(jié)果顯示，nTiO2處理誘導(dǎo)CsgD磷酸化修飾水平顯著下調(diào)，而生物膜合成有關(guān)的BcsB、BcsZ、BcsC、SecG和SesY等在蛋白水平顯著上調(diào)。去磷酸化形式的CsgD可特異性結(jié)合到adrA啟動(dòng)子區(qū)域并激活器其轉(zhuǎn)錄，而通常AdrA通過上調(diào)環(huán)二鳥苷酸水平介導(dǎo)BcsBAZC等蛋白合成纖維素?？傊?，nTiO2誘導(dǎo)的CsgD蛋白磷酸化修飾變化，介導(dǎo)了大腸桿菌生物膜形成的調(diào)控過程，從而影響大腸桿菌對(duì)亞致死濃度的nTiO2適應(yīng)性。

小編小結(jié)

盡管納米材料和微生物之間的相互作用具有廣泛的生態(tài)和健康影響，但微生物對(duì)納米材料的適應(yīng)機(jī)制仍不清楚。本研究中，在黑暗條件下暴露于nTiO2的活性污泥中形成的生物膜生物量增加，并選擇性地富集病原體。蛋白質(zhì)多組學(xué)分析結(jié)果表明，nTiO2脅迫進(jìn)一步導(dǎo)致條件致病菌的鐵載體過表達(dá)，通過相關(guān)轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白的去磷酸化增強(qiáng)其耐藥性。nTiO2會(huì)促進(jìn)生物膜的生成，提高致病菌的適應(yīng)性，從而會(huì)加速生物污染，導(dǎo)致潛在的生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)。
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