隨著新靶點(diǎn)的確定和治療方法的不斷完善，肺癌治療領(lǐng)域取得了重大進(jìn)展。特別是靶向治療的出現(xiàn)，如酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)，因其能夠改善反應(yīng)且副作用更少而獲得認(rèn)可。盡管第三代TKIs Osimertinib在延長(zhǎng)生存期和降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，但長(zhǎng)期治療的患者仍然會(huì)遇到耐藥性和疾病進(jìn)展。

環(huán)狀RNA（circRNAs）是非編碼RNA的一個(gè)亞類，其獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其在各種生物過(guò)程中具有多樣化和持續(xù)的功能作用。雖然環(huán)狀RNA參與癌癥的發(fā)生、進(jìn)展、耐藥和復(fù)發(fā)已經(jīng)被廣泛研究，但它們?cè)诜伟┲委熤械木唧w作用，特別是它們與TKIs的相互作用，仍然知之甚少。

2023年7月1日，陜西省西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科孫欣博士團(tuán)隊(duì)在Molecular Cancer（IF=37.3）發(fā)表文章Enhancement of TKI sensitivity in lung adenocarcinoma through m6A-dependent translational repression of Wnt signaling by circ-FBXW7。通過(guò)生信分析和陣列研究，作者發(fā)現(xiàn)circFBXW7在Osimertinib耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)顯著降低，circFBXW7的異常表達(dá)決定細(xì)胞對(duì)Osimertinib的反應(yīng)。circFBXW7抑制癌癥干細(xì)胞的更新，并使耐藥LUAD細(xì)胞和干細(xì)胞對(duì)Osimertinib重新敏感。機(jī)制方面，發(fā)現(xiàn)circFBXW7可以翻譯成circFBXW7-185AA的短多肽，以依賴m6A的方式與β-catenin相互作用，并通過(guò)誘導(dǎo)隨后的泛素化導(dǎo)致β-catenin穩(wěn)定性降低，從而抑制Wnt信號(hào)的激活。作者預(yù)測(cè)m6A閱讀器YTHDF3與hsa-Let-7d-5p具有共同的結(jié)合位點(diǎn)，強(qiáng)制表達(dá)Let-7d轉(zhuǎn)錄后降低了YTHDF3的水平。Wnt信號(hào)對(duì)Let-7d的抑制釋放了YTHDF3對(duì)m6A修飾的刺激，促進(jìn)了circFBXW7-185AA的翻譯。這就產(chǎn)生了一個(gè)積極的反饋，促進(jìn)了癌癥的發(fā)生。

肺腺癌中Wnt信號(hào)激活導(dǎo)致較差的生存結(jié)果和TKI治療耐藥性

在肺癌組織中Wnt信號(hào)效應(yīng)因子SOX和Snail家族的異常表達(dá)狀態(tài)最為顯著，作者利用RNA陣列和芯片序列檢測(cè)到SOX家族的異常表達(dá)。為了測(cè)試Wnt信號(hào)在評(píng)估Osimertinib治療效果中的作用，作者在ROC-Plotter相關(guān)的Dep-map計(jì)算中應(yīng)用了KEGG通路評(píng)估，結(jié)果如圖1D所示。顯著表達(dá)的Wnt因子參考圖1D的文本標(biāo)簽，差異表達(dá)最多的功能因子和配體列于圖1E。作者應(yīng)用Wnt信號(hào)基因簇預(yù)測(cè)TKIs治療作用，發(fā)現(xiàn)Wnt通路異常激活與多種反應(yīng)和長(zhǎng)期治療結(jié)果顯著相關(guān)。

激活Wnt信號(hào)維持干細(xì)胞更新并促進(jìn)TKI抗性

在惡性腫瘤中，一小群處于休眠狀態(tài)的干細(xì)胞保持一致的沉默，直到被觸發(fā)，釋放出它們巨大的繁殖潛力。研究表明，與鄰近的正常癌細(xì)胞相比，耐藥的H1975OR細(xì)胞和HCC827OR細(xì)胞含有更多的干細(xì)胞。因此，作者開始尋找能夠準(zhǔn)確區(qū)分這組干細(xì)胞的潛在標(biāo)記。其在HCC827和H1975細(xì)胞系中鑒定出表達(dá)CD133+/CD24?標(biāo)記或ALDH1A1+標(biāo)記的較小的干細(xì)胞樣細(xì)胞組。此外，ALDH1A1+細(xì)胞表現(xiàn)出自我更新和形成球體的能力，并對(duì)2uM的Osimertinib治療表現(xiàn)出固有的抗性。作者檢查并證實(shí)了Wnt信號(hào)效應(yīng)物在肺癌干細(xì)胞及耐藥細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。作者采用Capmatinib、TCF-4、SNAI1和SOX2抑制方法抑制Wnt功能，促進(jìn)了對(duì)稱細(xì)胞分化，減少了不對(duì)稱和對(duì)稱細(xì)胞的自我更新，極大地破壞了成球能力。

TKI耐藥肺癌細(xì)胞中失調(diào)環(huán)狀RNA的特征

為了生成一個(gè)circRNAs分析數(shù)據(jù)庫(kù)，并測(cè)試其翻譯概率。作者對(duì)耐藥的HCC827OR細(xì)胞和H1975OR細(xì)胞的rRNA去除后的總RNA進(jìn)行了RNA-seq分析。進(jìn)行多種功能分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的circRNAs主要參與microRNAs功能和細(xì)胞分裂并導(dǎo)致耐藥。發(fā)現(xiàn)由失調(diào)環(huán)狀RNA驅(qū)動(dòng)的分子功能和細(xì)胞成分被破壞，具有顯著失調(diào)和潛在異常功能的候選環(huán)狀RNA在圖3F中展現(xiàn)。

m6A介導(dǎo)circ-FBXW7表達(dá)促進(jìn)干細(xì)胞的更新抑制

作者發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞的總RNA的m6A水平比敏感的原始細(xì)胞更豐富，表明m6A參與了治療耐藥。采用Arraystar測(cè)序技術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞和鄰近癌細(xì)胞之間每個(gè)環(huán)狀RNA的m6A差異，將強(qiáng)m6A特征的失調(diào)環(huán)狀RNA與圖3A切片的篩選結(jié)果進(jìn)行比較，選擇hsa_circ_0001451進(jìn)行研究。差異表達(dá)的hsa_circ_0001451(circ-FBXW7)在circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行匹配，并評(píng)估其在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)模式。

為了進(jìn)一步表征m6A在產(chǎn)生抗性中的不確定作用，作者通過(guò)慢病毒敲低YTHDF3，發(fā)現(xiàn)YTHDF3強(qiáng)烈影響circ-FBXW7水平，并通過(guò)免疫印跡和LC-MS/MS測(cè)試證實(shí)了這一點(diǎn)。為了驗(yàn)證m6A對(duì)干細(xì)胞的控制，作者發(fā)現(xiàn)抑制YTHDF3促進(jìn)干細(xì)胞的增殖，證明了YTHDF3/m6A/circFBXW7的功能級(jí)聯(lián)作用。

m6A刺激circ-FBXW7-AA的翻譯決定干細(xì)胞的分化

circ-FBXW7連接檢測(cè)ORF和內(nèi)部核糖體入口位點(diǎn)(IRES)的探針，啟動(dòng)獨(dú)立翻譯。FLAG抗體在293 T細(xì)胞中驗(yàn)證Circ-FBXW7-AA上調(diào)。作者發(fā)現(xiàn)，m6A影響circ-FBXW7-185AA的翻譯效率，其中YTHDF3決定環(huán)狀RNA的表達(dá)和AA肽水平，抑制閱讀器YTHDF3顯著降低了circFBXW7-185AA的表達(dá)。過(guò)表達(dá)circ-FBXW7抑制干細(xì)胞組的增殖，抑制YTHDF3不能刺激circ-FBXW7依賴性分化細(xì)胞的分化。

抑癌基因和致癌基因的不配對(duì)分布最終導(dǎo)致子細(xì)胞具有不同的特征，為了證明子細(xì)胞的不同特征，作者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，circ-FBXW7陰性的細(xì)胞）（circ-/H3K27me3+/ALDH1A1+）顯示出更高的球體形成能力；與陽(yáng)性對(duì)照組和具有陰性circ-FBXW7和陽(yáng)性H3K27me3/ALDH1A1標(biāo)記的細(xì)胞相比，具有circ-FBXW7+/H3K27me3-/ALDH1A1-表型標(biāo)記的陽(yáng)性組的球體形成能力大大下降。增強(qiáng)circ-FBXW7刺激對(duì)稱分化分裂，從而導(dǎo)致球體形成受到抑制，并影響腫瘤的形成。

過(guò)表達(dá)circ-FBXW7影響Wnt/β-catenin通路的下游信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制更新。CO-IP實(shí)驗(yàn)表明，HCC827和H1975細(xì)胞中circ-FBXW7-185AA與β-catenin相互作用。circ-FBXW7-185AA的多肽可能以翻譯后調(diào)節(jié)的方式調(diào)節(jié)β-catenin；作者通過(guò)環(huán)己胺（CHX）試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，circ-FBXW7-185AA對(duì)β-catenin的蛋白穩(wěn)定性有負(fù)調(diào)節(jié)作用。β-catenin的泛素化對(duì)Wnt/β-catenin的傳導(dǎo)功能穩(wěn)定性起著重要作用，β-catenin的泛素化水平隨著過(guò)表達(dá)circ-FBXW7-185AA逐漸增加，而加入MG132又削弱了circFBXW7-185AA對(duì)β-catenin表達(dá)的抑制作用。

circ-FBXW7抑制Wnt/β-catenin信號(hào)激活，釋放Let-7d形成正向信號(hào)回路

作者推測(cè)circ-FBXW7和let-7家族miRNAs之間的潛在聯(lián)系可能在干細(xì)胞的更新和治療耐藥中具有重要價(jià)值。首先證實(shí)circ-FBXW7顯著刺激Let-7d，并且在耐Osimertinib的HCC827OR和H1975OR細(xì)胞中Wnt信號(hào)抑制并釋放Let-7d表達(dá)。抑制β-catenin強(qiáng)烈刺激Let-7d的表達(dá)，circ-FBXW7、si-β-catenin或聯(lián)合使用組之間的差異不明顯，表明它們的功能相似。

為了進(jìn)一步闡明Let-7d相關(guān)調(diào)控機(jī)制，作者對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，在YTHDF3和Let-7 miRNAs的m6A閱讀器中找到預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)改變Let-7b/d/i時(shí)，YTHDF3 mRNA沒有明顯變化；但當(dāng)引入Let-7d時(shí)，蛋白質(zhì)水平大大降低。增強(qiáng)Let-7d抑制野生型YTHDF3 mRNA的熒光素酶活性，但在突變組中不起作用。研究結(jié)果表明，增強(qiáng)Let-7d可以以依賴YTHDF3抑制的方式抑制circ-FBXW7的表達(dá)，形成一個(gè)負(fù)反饋回路。綜上，無(wú)論是增強(qiáng)circ-FBXW7，增強(qiáng)Let-7d，還是抑制YTHDF3，都能降低H1975OR和HCC827OR耐藥細(xì)胞的自我更新能力，并縮小帶有ALDH1A1表面標(biāo)記的干細(xì)胞群。

小結(jié)

作者研究表明，circFBXW7通過(guò)作用于β-catenin泛素化和抑制來(lái)調(diào)節(jié)Wnt通路功能，從而有效抑制LUAD干細(xì)胞的能力和逆轉(zhuǎn)TKIs的耐藥性。m6A通過(guò)影響干細(xì)胞群中circRNA的環(huán)化和翻譯，在維持耐藥狀態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。這種機(jī)制有效地將不斷更新的干細(xì)胞推向臨床治療的前沿，在增強(qiáng)治療策略和克服多種TKI治療耐藥方面具有巨大潛力。

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https://doi.org/10.1186/s12943-023-01811-0