乳腺癌（BC）是全球婦女中最常見的癌癥類型，已成為影響婦女健康的主要威脅。BC在癌癥發(fā)病率中排名第一，在癌癥死亡率中排名第五，分別占全球所有癌癥病例的11.7%和所有癌癥死亡病例的6.9%。近幾十年來，由于早期診斷、化療、內(nèi)分泌治療和分子靶向治療的發(fā)展，BC的5年生存率有了顯著提高。然而，BC在大多數(shù)國家的死亡率和復(fù)發(fā)頻率仍較高。因此，迫切需要探索更特異性、更有效的診斷生物標志物和治療靶點。

環(huán)狀RNA是在真核生物中通過非典型反向剪接產(chǎn)生的共價閉合RNA分子，不存在5‘帽子和3’poly-A尾巴，從而賦予環(huán)狀RNA對外切酶的抗性和比線性RNA更高的穩(wěn)定性。越來越多的研究表明，環(huán)狀RNA可以作為生物標記物，對疾病診斷、預(yù)后和治療具有重要臨床意義。目前已知，環(huán)狀RNA可以通過作為miRNA海綿和調(diào)控信號通路參與癌癥的發(fā)病機制，而進一步研究環(huán)狀RNA的功能有助于解析環(huán)狀RNA在乳腺癌發(fā)展中的潛在分子作用機制。

2023年8月25日，鄭州大學(xué)附屬第一醫(yī)院賀靖/賀付成/羅陽團隊在Cell Death & Disease（IF=9.0）發(fā)表文章“EIF4A3-mediated circ_0042881 activates the RAS pathway via miR-217/SOS1 axis to facilitate breast cancer progression”。作者研究了一種由神經(jīng)纖維瘤蛋白1（NF1)轉(zhuǎn)錄本剪接得到的環(huán)狀RNA（circ_0042881）。體外和體內(nèi)實驗證明，與健康組織和細胞相比，circ_0042881的表達水平在BC組織和細胞系中顯著升高，并促進了BC細胞的增殖、遷移和侵襲。作者還闡明了circ_0042881作為競爭內(nèi)源性RNA（ceRNA）調(diào)控BC細胞轉(zhuǎn)錄后階調(diào)控基因（SOS1）表達的潛在作用機制。此外，NF1 pre-mRNA包含真核啟動因子EIF4A3的結(jié)合位點，可以促進circ_0042881的生成。這項研究表明，circ_0042881可能作為一種預(yù)后的生物標志物或BC患者的潛在治療靶點。

circ_0042881在BC中的表達及特征分析

作者對56對BC組織和鄰近的非腫瘤組織進行了RT-qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)circ_0042881在BC組織中的表達水平明顯較高。同時，作者也發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，BC患者血漿中circ_0042881表達水平顯著升高。此外，circ_0042881的過表達在BC細胞系中得到進一步驗證，且相對于其它BC細胞系，在MCF-7和MDA-MB-231這兩種細胞系中檢測到了更高的表達水平。作者使用放線菌素D確定了circ_0042881比親本mRNA更加穩(wěn)定。通過FISH實驗確定了circ_0042881主要分布在BC細胞的細胞質(zhì)中。綜上表明，circ_0042881主要存在于BC細胞的細胞質(zhì)中，其在腫瘤組織和血漿中的高表達水平表明circ_0042881可能是一種可行的BC生物標志物（如圖1）。

Circ_0042881促進BC細胞增殖、遷移和侵襲

為了驗證circ_0042881在BC細胞中的功能，作者構(gòu)建了敲低circ_0042881和過表達circ_0042881的BC細胞模型。通過RT-qPCR檢測表明circ_0042881的敲低不會影響其親本NF1 mRNA的轉(zhuǎn)錄。通過CCK-8檢測顯示敲低circ_0042881顯著抑制BC細胞的生長。集落形成實驗證明敲低circ_0042881后，MDA-MB-231和MCF-7的增殖能力降低。此外，作者通過transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)敲低circ_0042881組的遷移和侵襲細胞數(shù)量明顯減少。以上數(shù)據(jù)表明circ_0042881可以增強BC細胞的增殖、遷移和侵襲（如圖2）。

circ_0042881作為miR-217的海綿

鑒于circ_0042881是一個由外顯子反向剪接產(chǎn)生的環(huán)狀RNA，并且主要位于細胞質(zhì)中，作者推測其可能會作為miRNA海綿來控制基因表達。作者使用anti-AGO2進行了RIP實驗，實驗證明circ_0042881在anti-AGO2組內(nèi)明顯富集。利用circBANK數(shù)據(jù)庫預(yù)測了circ_0042881的潛在靶標miRNA并結(jié)合qPCR檢測，結(jié)果表明circ_0042881可能在BC中起到miR-217海綿的作用。為了驗證上述結(jié)果，作者利用熒光素酶報告實驗證明了二者存在結(jié)合。綜上表明，circ_0042881和miR-217可以直接相互作用（如圖3）。

SOS1是miR-217的靶點

為了確認miR-217的潛在下游靶基因，作者對有無轉(zhuǎn)染miR-217的細胞做了轉(zhuǎn)錄組差異分析，通過miRDB數(shù)據(jù)庫比對以及RT-qPCR分析，結(jié)果顯示只有SOS1基因與circ_0042881的表達水平呈正相關(guān)。通過雙熒光素酶實驗驗證了miR-217可以直接結(jié)合SOS1的3'UTR區(qū)域。隨后，作者通過WB實驗發(fā)現(xiàn)當circ_0042881過表達后，SOS1的表達量增加也會伴隨著AKT和ERK磷酸化的增加。且使用BAY-293（抑制劑)處理細胞后，BAY-293顯著降低了circ_0042881引起的AKT和ERK磷酸化水平。綜上表明，circ_0042881可以通過海綿化miR-217從而提高SOS1的表達，進而誘導(dǎo)RAS蛋白促進AKT和ERK的磷酸化，最終激活MEK/ERK和PI3K/AKT通路（如圖4）。

circ_0042881通過SOS1/RAS通路加速BC細胞的增殖和遷移

接著，作者使用rescue實驗探索了circ_0042881是否會通過SOS1/RAS通路從而調(diào)節(jié)BC細胞的惡性行為。CCK-8實驗證實circ_0042881的表達有助于BC細胞的增殖。而使用BAY-293沉默SOS1或阻斷SOS1與RAS的相互作用可逆轉(zhuǎn)上調(diào)circ_0042881對BC細胞的增殖效果。此外，transwell實驗和傷口愈合實驗的結(jié)果也證實了circ_0042881的上調(diào)有利于BC細胞的遷移和侵襲。同時修復(fù)實驗表明敲低circ_0042881對細胞增殖、遷移和侵襲的限制作用可以通過SOS1的表達逆轉(zhuǎn)。綜上所述，作者證實circ_0042881可以通過激活SOS1/RAS信號通路促進BC細胞的增殖、侵襲和遷移（如圖5）。

EIF4A3作為circ_0042881的上游目標

為了進一步分析circ_0042881是否可以被RBP調(diào)控，作者預(yù)測了circ_0042881可能的RBP結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)EIF4A3（真核翻譯起始因子4A3）擁有最多的結(jié)合位點。RIP實驗表明，EIF4A3在4個推測的結(jié)合位點與NF1 pre-mRNA的側(cè)翼序列結(jié)合。通過WB和RT-qPCR證實缺乏EIF4A3可以抑制circ_0042881的表達。此外，作者使用EdU檢測發(fā)現(xiàn)阻斷EIF4A3會明顯抑制細胞的生長。通過transwell和傷口愈合試驗檢測顯示抑制EIF4A3會阻抑BC細胞的遷移和侵襲能力，而過表達circ_0042881則會促進BC細胞的發(fā)育。綜上說明，EIF4A3可以促進circ_0042881的反向剪接過程，加速BC惡性進展（如圖6）。

Circ_0042881在體內(nèi)加速BC細胞的腫瘤發(fā)生和遷移

最后，為了評估circ_0042881在BC進展中的作用，作者使用原位BC小鼠模型進行了腫瘤發(fā)生分析。研究發(fā)現(xiàn)異位表達的circ_0042881會導(dǎo)致異種原位移植體更快的形成腫瘤。WB結(jié)果顯示，circ_0042881表達的腫瘤組織中p-AKT和p-ERK表達升高。此外，作者建立了實驗性肺轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)和健康肺組織相比，circ_0042881過表達的BC細胞系產(chǎn)生了更多的轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)?？傊?，上述體內(nèi)研究補充了體外研究結(jié)果，強調(diào)了circ_0042881在BC生長和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用（如圖7）。

總結(jié)

作者發(fā)現(xiàn)了一種新的環(huán)狀RNA circ_0042881，它在BC組織中顯著升高，并與TNM分期相關(guān)。circ_0042881通過與miR-217的競爭性結(jié)合，控制SOS1的表達，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)（包括MEK/ERK通路和PI3K/AKT通路），從而參與癌癥的發(fā)展。此外，RNA結(jié)合蛋白EIF4A3通過結(jié)合circ_0042881的側(cè)翼區(qū)域促進其表達?？傊?，作者的研究發(fā)現(xiàn)了一個新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它對BC細胞的生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，可能為BC的診斷和治療提供有價值的生物標志物。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41419-023-06085-4