ANEXT安齡生物·細胞外囊泡分離技術
ANEXT安齡生物·細胞外囊泡分離技術
巨噬細胞外泌體協(xié)助mRNA-LNPs療法治療難治性胰腺疾病
EV在復雜的體液環(huán)境中體積小、密度低、分布廣，使得研究人員在分離和分析后獲得高純度EV極具挑戰(zhàn)性。這也限制了它們的臨床應用?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了幾種新技術和商業(yè)產(chǎn)品來隔離EV。這些基于利用EV物理特性的分離原理，例如它們的密度、質量和形狀。此外，還可以根據(jù)EV的理化和生化特性進行分離，例如電荷、流體動力學、溶解度和表面特性（蛋白質）。已經(jīng)開發(fā)了幾種常規(guī)分離方法，每種方法都有自己的優(yōu)點和缺點。因此，根據(jù)EV的不同特性，可以以單一或組合的方式進行分離。
1、超速離心
超速離心（UC）是最常用的方法，也是目前EVs分離的金標準。在這種方法中，EV被分離，因為它們的沉降系數(shù)與其他顆粒的沉降系數(shù)不同。簡而言之，UC是一種差速離心方法，其中離心力逐漸增加，首先以2000-4000×g的低離心力去除死細胞和細胞碎片;去除凋亡囊泡、MV、生物聚合物等，濃度為10000-20000×g;并以100000-200000×g的高離心力沉淀外泌體。使用UC分離毛囊和脂肪組織間充質干細胞衍生的EV。在研究中，首先收集含有培養(yǎng)基的細胞，然后在2000×g和4°C下離心10分鐘以除去細胞碎片，然后將上清液以10000×g離心30分鐘。最后，使用第二上清液在以100000×g離心90分鐘后獲得EV。利用UC從前列腺癌細胞和正常前列腺上皮細胞中提取外泌體，他們開發(fā)了一種3D-SiO2多孔芯片用于小鼠腫瘤分期和前列腺癌的早期臨床檢測。然而，離心參數(shù)例如使用振蕩桶或固定角度轉子以及離心持續(xù)時間，會影響分離囊泡的產(chǎn)量和純度。結果表明，適當延長離心時間可以提高外泌體中的蛋白質和RNA產(chǎn)量，而僅靠轉速無法預測外泌體的造丸能力。?
此外，UC會由于高離心力而對囊泡造成機械損傷，從而導致囊泡與實底血管之間的碰撞。這會降低分離外泌體的純度，并由于囊泡異質性導致存在一些污染物蛋白質聚集體。
2、密度梯度超速離心
密度梯度離心（DGC）是一種基于EV尺寸、形狀、質量和密度的改進超速離心方法。在密度梯度溶液中，當每個顆粒的離心力與浮力平衡時，由于密度不同，不同的組分在從上到下的梯度中積累在不同位置。因此，外泌體可以與樣品中的其他成分分離。通常，蔗糖或碘二醇用于產(chǎn)生密度梯度。使用差速離心和額外的Optiprep?密度梯度超速離心提取水蚤原始小膠質細胞釋放的EV。使用質譜法測定了分離的EV的蛋白質含量，發(fā)現(xiàn)DGC的使用消除了污染物，并限制了分離過程中存在的蛋白質聚集體和其他膜顆粒的共分離效果。使用DGC從人類唾液中分離EV，并將其與從細胞培養(yǎng)上清液中分離的EV進行比較。他們發(fā)現(xiàn)唾液EV的體積和密度分別為47.8±12.3nm和1.11g/mL，而細胞EV的體積和密度分別為74±23.5nm和1.06g/mL。因此，唾液EV的體積較低，密度較高。
DGC需要跨不同梯度的分離，并且需要時間在梯度中的每個點達到平衡。因此，此過程相對耗時且時間敏感，但操作相對簡單。
3、體積排阻色譜
體積排阻色譜（SEC）是一種基于粒徑差異的分離技術。它也被稱為凝膠過濾。色譜柱中的固定相由多孔珠（例如，瓊脂糖、瓊脂糖、瓊脂丙烯酸和Biogel P）組成。當添加樣品時，大顆粒無法進入孔隙并被洗脫出來，在色譜柱中保留的時間較短。同時，小顆粒進入孔隙，其洗脫速率顯著降低。因此，實現(xiàn)了分離。如何使用SEC從不同的生物體液中分離EV。注射器或帶有過濾器的空柱可用于設置SEC，同時在注射器的尖端放置尼龍網(wǎng)。隨后可以添加緩沖液以潤濕過濾器并防止氣泡。隨后，可以加入所需體積的凝膠過濾基質、填充洗脫緩沖液、潤濕，最后使用。使用SEC從人體滑液中分離EV，并證明SEC可以通過超速離心耗盡EV濃縮后殘留的污染物。此外，使用高分辨率質譜分析，他們發(fā)現(xiàn)蛋白酶K成功去除纖連蛋白和其他細胞外蛋白。由于脂蛋白顆粒的存在，很難從血液中分離EV。因此，將SEC與密度緩沖相結合，將脂蛋白顆粒與EV分離，同時將脂蛋白顆粒的污染減少100倍，從而提高EV的純度。比較了SEC和UC從尿液中提取外泌體方面，發(fā)現(xiàn)SEC在回收外泌體顆粒和蛋白質方面優(yōu)于UC，提取的外泌體更多。相反，在UC過程中，發(fā)生破裂和不完全沉淀，導致外泌體蛋白回收率降低，外泌體顆粒明顯損失。將SEC純化的外泌體與EA.hy926和HCV29細胞系的外泌體進行比較，在共孵育后4-6小時顯示出較高的內(nèi)化能力。
因此，與用UC提取的EV相比，使用SEC提取的EV具有更高的純度。然而，SEC在操作上更具挑戰(zhàn)性，需要額外的設備。
4、超濾
超濾（UF）的原理基于分子大小。該過程類似于傳統(tǒng)的過濾方法，因為較大的顆粒被過濾器保留，而較小的顆粒通過一個或多個具有不同孔徑或MWCO（分子量截止值）的膜。切向流過濾（TFF）也基于這一原理，是UF的高級形式。使用TFF從微藻中分離EV，截止值為650、200和20nm。為了提高樣品純度和產(chǎn)量，評估了不同的技術參數(shù)和條件，以提高EVs的分離。發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的基于TFF的生物工藝適用于大規(guī)模生產(chǎn)。比較了UC和TFF從MDA-MB-231乳腺癌細胞培養(yǎng)物中分離EV的情況。發(fā)現(xiàn)TFF在產(chǎn)量和去除單個大分子和聚集體方面更勝一籌。開發(fā)了一種優(yōu)化UF的方法，方法是引入0.22μm過濾器和MWCO為10000 kDa的透析膜，以去除大于200nm的細胞外微泡。使用離心超濾和100kDa MWCO納米膜過濾裝置從支氣管肺泡灌洗液中分離EVs，發(fā)現(xiàn)該過程提供的EV分布比UC和DGC更小，更均勻。與UC相比，UF和SEC將每毫升培養(yǎng)基回收小型EV的能力提高了約400倍。
然而，當使用UF時，膜容易堵塞和剪切力，這會在過濾過程中破壞EV。然而，操作更簡單。
5、場流分餾
用于場流分餾的分離裝置是一個薄而扁平的通道，高度為50–500μm。在垂直于樣品流的方向上施加力場，隨后聚焦在通道壁的一側，其中顆粒由于其不同的尺寸而與壁保持不同的距離。離側壁較遠的較小顆粒在較大顆粒之前被洗脫。有不同類型的外部場，如電場、重力場、溫度場和錯流場，它們可用于根據(jù)其生物物理特性分離樣品。其中，研究最廣泛的是非對稱流場分餾（AF4）中的錯流場。AF4可用于從人血漿中的高密度脂蛋白（HDL）和脂蛋白顆粒（LDL）中分離EV，具有高純度和重現(xiàn)性。此外，他們發(fā)現(xiàn)人EV在人血漿中的濃度高于等體積的配對血清樣品，并且人血漿中EV量的個體差異與年齡和性別無關。最后，他們優(yōu)化了AF4技術和樣品制備工藝參數(shù)。使用流場-流分餾法根據(jù)Hb1.F3永生化人類神經(jīng)干細胞（HMSC）的不同流體動力學直徑從Hb.F中分離濃縮外泌體。采用流場流分級法根據(jù)尿外泌體的大小進行分離，發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者的外泌體幾乎是健康個體的兩倍。
然而，在該方法中，分離過程中的樣品量很小，因此不允許進行大規(guī)模的分離和提取。此外，還需要事先分餾和濃縮。然而，該技術具有很高的重現(xiàn)性和分辨率。
6、沉淀法
聚合物沉淀法涉及將相關生物流體與聚合物溶液混合，然后低速離心以促進外泌體沉淀并獲得外泌體。加入不同分子量的50%聚乙二醇（PEG），使最終濃度達到6、8、10、12和15%PEG和75mM NaCl。在優(yōu)化方法后，最終選擇添加PEG6000和NaCl，以達到10%PEG和75mM NaCl的濃度。孵育8小時后，可除去大量牛血清蛋白。然而，研究表明，用PEG制備的EV樣品仍可能保留一定比例的非EV相關分子。在SEC步驟之前使用PEG從細胞培養(yǎng)基中沉淀外泌體可以提高常規(guī)SEC方法的分辨率，因為PEG會沉淀可溶性蛋白質。此外，基于聚合物的沉淀與SEC（Pre-SEC）方法相結合可以幫助分離分泌EV亞型的單個細胞類型。如今，基于聚合物共沉淀的商用試劑盒可用于EV分離。使用miRCURY?外泌體分離試劑盒從血漿中獲得豐富的EVs特異性miRNA。他們發(fā)現(xiàn)基于沉淀的方法不足以從血漿中純化含有EVs的miRNA貨物。雖然可以去除部分無囊泡miRNA，但無囊泡miRNA在該方法分離的血漿EV沉淀物中仍然占主導地位。比較了UC、PEG方法和兩種商業(yè)試劑盒（Exoquick和PureExo）從健康供體血液中分離gDNA-EV的性能。他們發(fā)現(xiàn)PEG方法可以提高gDNA產(chǎn)量，降低成本和時間。
除了基于聚合物的沉淀外，基于電荷的沉淀還可用于EV分離。使用帶正電荷的魚精子蛋白誘導血清、唾液和細胞上清液中的EV沉淀。當使用35000Da PEG沉淀魚精子蛋白時，促進了EV的重懸，并且沉淀EV的回收率比通過使用電荷超速離心獲得的EV更有效。沉淀法避免了對昂貴設備的需求，適用于從小型生物樣品中分離EV。使用硫酸銨進行鹽析，從脫脂牛奶中分離EV，實現(xiàn)與UC相當?shù)募兌群彤a(chǎn)量，而使用ExoQuick試劑盒分離的EV純度較低。他們還驗證了EV作為治療載體的相關功能。
在沉淀方法中，聚合物的污染可能會降低純度。雖然這些套件價格昂貴，但它們易于操作且隨時可用。
7、微流體
通過微流控芯片對EV進行分離定量，具有樣品體積小、檢測速度快、多通道檢測易于實現(xiàn)等優(yōu)點而受到廣泛關注。設計了一種基于膜的微流控平臺，使用兩個膜過濾器進行EV分離和計數(shù)，用于從血液中快速分離和定量EV。首次使用0.2μm聚碳酸酯膜進行攪拌增強過濾以分離小型EV，分離率超過99%。氧化鋁膜上的CD63免疫染色顯示熒光標記的CD63+EVs，可在顯微鏡下計數(shù)。通過分析熒光斑點尺寸分布，可以估計單個EV的外泌體蛋白表達。創(chuàng)建了一個基于親和捕獲的微流體平臺。它由兩個微流體芯片組成：一個馬蹄形口混合器（HOMM）單元和一個魚陷阱形狀的微過濾器單元（魚陷阱），分別用于捕獲和洗脫純化。這些芯片可以組合使用或單獨操作，EV的捕獲、富集和釋放可以在5分鐘（100μL樣品）內(nèi)完成。開發(fā)了一種用于EV分離的微流體兩相水系統(tǒng)（ATPS）。ATPS裝置有三個入口和三個出口，形成兩個兩相水流界面層，以PEG和葡聚糖ATPS為微流控通道。該設備可以從EVs-蛋白質混合物中回收高達83.4%的EV，并去除高達65.4%的雜質。
通過微流體分離EV是近年來發(fā)展起來的一種相對較新的方法。由于自動化、低樣品要求和程序的高通量性質，它逐漸引起研究人員的關注。但是，需要解決有關大規(guī)模應用的問題（降低制造和操作的復雜性）。
8、基于親和力的方法
基于化學親和力的EV分離已被廣泛研究?；谟H和力的方法可分為兩大類：目標EV捕獲和非目標EV捕獲。為了靶向捕獲EV，使用高親和力抗體、適配體和肽的組合靶向EV表面的各種生物分子。同時，非靶向捕獲使用脂質探針、磷脂酰絲氨酸（PS）和TiO?；贓V表面脂質的高親和力提取EV。使用傳統(tǒng)的球形免疫磁珠會導致較低的濃度和回收效率，因為磁珠的表面光滑和剛性界面修飾。一種使用脂質標記和磁珠的新技術，首先插入脂質基序DSPE-PEG1000-TCO，該基序標記血漿中的EV，然后使用生物正交點擊化學將TCO標記的EV固定在四嗪（TZ）接枝微球（小貼）上。然后通過離心分離小貼紙上的EV，最后使用逆轉錄數(shù)字PCR（RT-dPCR）分析EV中的mRNA。與基于免疫親和力的EVs標記不同，基于免疫親和的EVs標記受EVs表面特異性抗原（CD63、CD81、CD9）數(shù)量的限制，基于脂質的EVs標記物獨立于EVs表面抗原。這些標志物與RT-dPCR同時組合可以量化尤文肉瘤和胰腺癌的致癌變化，證明其在監(jiān)測治療反應和疾病進展方面具有潛在的臨床價值。開發(fā)了免疫磁性刺猬顆粒（IMHP）來捕獲和釋放外泌體。這些顆粒用于從MCF-7細胞中捕獲外泌體，捕獲率高達91.7%。與通過UC獲得的外泌體相比，通過該方法獲得的外泌體保持了其結構完整性并顯示出良好的生物活性。利用了富含磷脂酰絲氨酸的外泌體表面和SiO上的固定肽配體2微球誘導特異性相互作用并分離外泌體，并使用該方法從血清中分離外泌體。
使用DNA定向固定化（DDI）策略，通過固定與磁性顆粒上的囊泡結合的抗CD63抗體來分離EV。也就是說，使用互補寡核苷酸對表面和抗體進行功能化，通過雙鏈DNA接頭的DNAse I催化酶促切割釋放EV。傳統(tǒng)方法基于通過加熱或超聲波破壞抗原抗體和改變其物理性質，用有機溶劑、堿和其他化學方法處理可能會損壞EV。然而，所提出的可逆DNA連接可以允許在酶切后釋放EV，克服這個問題，同時增強對抗CD63抗體的親和力?；谂cEVs表面的靜電相互作用、物理吸附和生物識別相結合，制備了一種由乳鐵蛋白偶聯(lián)樹枝狀修飾的磁性納米顆粒組成的嵌合納米復合材料，無需離心和抗體親和力即可分離EV。EV可以在30分鐘內(nèi)從細胞培養(yǎng)物和臨床標本中分離出來，但無法與其他類型的EV區(qū)分開來。
9、其他分離方法
使用電泳遷移和多孔膜從等離子體中分離EV，多孔膜由兩個電極之間并列的膜形成的三個流道組成。樣品在切向流中水平移動，并在施加的電壓下垂直遷移。然而，尺寸>30nm的帶負電的EV無法通過孔并積聚在膜上，隨后用PBS洗滌膜以收集EV。使用瓊脂糖凝膠電泳從血漿脂蛋白中分離EV，該方法基于EV大小和zeta電位的差異。通過電泳回收的EV的形態(tài)與典型EV的形態(tài)一致。Naohiro一種使用陰離子交換制備外泌體的有效方法，其中細胞上清液首先通過0.22μm保留濾膜分離，然后使用陰離子交換柱層洗脫EV。該方法被證明最適合制備符合GMP標準的EV以供臨床使用。
綜上所述，目前EV分離的方法多種多樣。但是，每種方法都有其優(yōu)點和缺點。無論采用何種方法，重要的是考慮分離的EV是否完整，以及是否可以通過結合不同的技術來優(yōu)化分離和純化。因此，可以有效地分離高純度EV，同時去除不需要的物質，確保安全并最大限度地降低成本以實現(xiàn)大規(guī)模運營。
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