眾所周知，HE染色是組織切片最常用的染色法之一。其中，蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸表現(xiàn)為藍色；伊紅為酸性染料，主要使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分呈現(xiàn)紅色。

但如何保證自己每一次都能完成漂亮的染色呢？有道是老馬都可以失前蹄兒，為了讓大家對HE染色有著更清晰的認識，我特地搜集查詢了下面的內(nèi)容，希望能對大家的染色技巧有一定的提升。

一、實驗原理

細胞漿染色的原理

伊紅是一種化學合成的酸性染料，在一定條件下可使細胞漿著色。細胞漿的主要成分是蛋白質(zhì)，為兩性化合物，細胞漿的染色與染液的pH在胞漿蛋白質(zhì)等電點（4.7—5.0）以下時，胞漿蛋白質(zhì)以堿式電離，則細胞漿帶正電荷，就可被帶負電荷的酸性染料染色。伊紅在水中離解成帶負電荷的陰離子，與胞漿蛋白質(zhì)帶正電荷的陽離子結(jié)合，使細胞漿著色，呈現(xiàn)紅色。

細胞核染色的原理

蘇木精為堿性天然染料，可使細胞核著色。細胞核內(nèi)染色質(zhì)的成分主要是DNA，在DNA的雙螺旋結(jié)構中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側(cè)帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性燃料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。

分化作用

染色后，用某些特定的溶液將組織過多結(jié)合的染色劑脫去，這個過程稱為分化作用，所用的溶液稱為分化液。在HE染色中用0.5%鹽酸乙醇作為分化液，因酸能破壞蘇木精的醌型結(jié)構，使組織與色素分離而褪色。經(jīng)蘇木精染色后，必須用0.5%鹽酸乙醇分化，使細胞核過多結(jié)合的蘇木精染料和細胞漿吸附的蘇木精染料脫去，在進行伊紅染色，才能保證細胞核與細胞漿染色的分明。因此，在HE染色中分化是極為關鍵的一步。

返藍作用

分化之后，蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，呈紅色，在堿性條件下處于藍色離子狀態(tài)，呈藍色。組織切片經(jīng)0.5%鹽酸乙醇分化后呈紅色或粉紅色，故分化之后，立即用水出去組織切片上的酸而終止分化，再用弱堿性水（0.2%氨水）使蘇木精染上的細胞核呈現(xiàn)藍色，這個過程稱為返藍作用或藍化作用。

二、染色步驟詳解

烤片

1小時，溫度60℃-65℃（目的：使組織切片與載玻片貼合的更加緊密）；

具體染色步驟

三、HE染色實操注意事項

1.組織固定

組織樣本必須被充分固定，以防止處理過程中組織細胞的破壞。用10％緩沖福爾馬林（Formalin）進行固定通常是一個比較好的選擇。

2.切片制備

對于組織樣本的切片厚度和形狀需謹慎考慮。切片應該是均勻的，并且不能太薄或太厚。一般來說，4-5微米是一個常見的厚度。

3.pH值調(diào)節(jié)

染色時調(diào)節(jié)pH值很重要。組織切片在染色前必須在適當?shù)木彌_液中浸泡，在染色期間pH值應始終穩(wěn)定.如果組織塊在福爾馬林中固定時間長，組織酸化而影響細胞核著色。因此，要在自來水中沖洗時間長一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30min，這樣可以使細胞核著色較深。染伊紅時胞漿著色不佳，可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

4.控制分色時間

切片染蘇木精后，分色這一步是關鍵，應在顯微鏡下控制進行，一般以細胞核染色清楚（晰）而細胞質(zhì)基本無色為佳。如果過分延長分色時間將導致染色太淺，應重新染色后再行分色。

5.徹底脫去酒精

組織切片需要通過一系列的酒精濃度逐漸脫水，并用透明劑如苯酚、二甲苯等進行透明化。透明化后切片會變得更加清晰，便于染色。

切片經(jīng)酒精脫水后，入二甲苯時可出現(xiàn)白色不透明狀態(tài)，此為脫水不徹底，應將切片退回無水酒精，更換酒精、二甲苯，以求徹底脫水與透明。

6.保持切片的濕潤

在染色過程中不要讓切片干燥，以免切片收縮、變形，影響神經(jīng)元形態(tài)。

7.保持切片的濕潤

切片從二甲苯取出或進入二甲苯前，切片周邊均應擦干凈或吸干多余水分。

8.封片注意事項

最后封固時，要用中性樹脂，防止日后褪色，蓋片要選大于組織塊的面積，如漏出一部分不久將會褪色，所用樹脂濃度要適當，樹脂封固時不能有氣泡。

9.洗滌

洗滌步驟很重要。未充分清洗會導致染色劑殘留，影響結(jié)果的質(zhì)量。每個處理步驟后，應該用足夠的緩沖鹽水徹底洗滌。

10.避免空氣暴露

空氣中的灰塵和污染物會對實驗產(chǎn)生不利影響，因此在染色過程中，需要避免將切片長時間暴露在空氣中，并保持實驗室的清潔和衛(wèi)生。

11.監(jiān)控染色反應

染色的過程應該密切監(jiān)測，以便在必要時進行微調(diào)。需要管理好每個步驟的時間和溫度，以避免過度染色或染色不足的情況發(fā)生。

四、常見問題及解決方法

1.細胞核染色淺

原因：蘇木精染色時間太短；蘇木精染液過度氧化；分色時間過長；如果骨組織細胞核染色淺則是脫鈣過度造成的。另外如組織在酸性固定液如Zenker、Bouin及非中性緩沖甲醛液固定時間過長，細胞核著色能力也會變差。

解決方法：增加染色時間；或者提高組織的嗜堿性，如使用Weigert鐵蘇木精染色液。如組織是用Zenker液固定的，可將切片脫蠟后放在5%碳酸氫鈉溶液3~4小時，流水沖洗5min后再進蘇木素染液染色。如組織是用Bouin液固定的，可將切片脫蠟后放在5%碳酸鋰溶液1小時，流水沖洗10min后再進蘇木素染液染色。

2.切片在脫蠟后出現(xiàn)白色斑點

原因：烤片溫度太低，切片脫蠟時沒有充分烤干，脫蠟不徹底

解決方法：先用無水乙醇去除切片上的水分，然后重新用二甲苯脫蠟；脫蠟時間相應延長，或更換新的二甲苯（二甲苯用的時間長的話脫蠟效果會下降）。

3.細胞核染色太深

原因：蘇木精染色時間太長；分色時間過短。

解決方法：調(diào)整染色和分色時間。

4.細胞核呈棕色

原因：蘇木精染液過度氧化；染色后返蘭不足。

解決方法：及時更換染液；增加返蘭時間，必要時使用0.5%~1%的氨水返藍。

5.細胞質(zhì)過染、分色不足

原因：伊紅染液濃度過高或染色時間過長；75%乙醇和85%乙醇中時間過短。

解決方法：降低伊紅染液濃度或縮短染色時間，增加在75%乙醇、85%乙醇中的停留時間。

6.切片中出現(xiàn)藍黑色沉淀物

原因：氧化汞作為氧化劑的蘇木精染液會在染液表面形成氧化膜。

解決方法：用時用濾紙去除。

7.伊紅染色淺

原因：伊紅染液PH值過高；75%乙醇和85%乙醇中時間過長。

解決方法：用冰醋酸調(diào)整伊紅PH值為4.6~5.0；縮短在75%乙醇、85%乙醇中的停留時間。

8.封片后有氣泡

原因：封片時操作不當。

解決方法：用鑷子輕輕壓蓋玻片，趕出氣泡，如氣泡太多，趕不出且影響觀察時，把切片放入二甲苯中，去除中性樹膠，待蓋玻片從載玻片上自然脫落，重新封片。

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