蛋白由若干氨基酸脫水縮合排列構(gòu)成，含有一個游離的氨基（N端）和一個游離的羧基（C端）。C端與N端一樣，在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)分析中具有重要的地位，是蛋白質(zhì)完整一級結(jié)構(gòu)的必須信息，對C端序列進行測定具有重要的意義。

北京百泰派克生物科技有限公司基于CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量認證體系，根據(jù)肽圖分析（質(zhì)譜法）原理，建立了針對于不同類別生物制品的蛋白C端序列分析服務(wù)，可實現(xiàn)對蛋白、抗體、疫苗、多肽、重組膠原蛋白等生物制品C端序列的測定。

技術(shù)原理

目前尚未開發(fā)出類似于Edman降解的C端序列測定技術(shù)，因此蛋白C端序列的確證服務(wù)仍然是以質(zhì)譜平臺為基礎(chǔ)。根據(jù)靶蛋白理論序列信息選擇互補性好的兩種蛋白酶酶切蛋白，產(chǎn)生兩個長度不同但是適宜離子化的C端肽段，經(jīng)質(zhì)譜檢測，相互驗證，最終確定蛋白C端序列。

附常見蛋白酶酶切條件及位點：

實驗儀器

? 納升級高效液相色譜儀：Easy-nLC 1200；

? 組合型四極桿-Orbitrap質(zhì)譜儀：Q Exactive? Hybrid Quadrupole-Orbitrap? Mass Spectrometer。

案例示意

樣品蛋白經(jīng)過適合的蛋白酶酶切之后變成長度大多在6-28aa的肽段，進入質(zhì)譜分析后產(chǎn)生的總離子流譜圖如下：

樣品總離子流譜圖（TIC）

（橫坐標為時間（min），縱坐標為相對信號強度）

通過一級質(zhì)譜圖可以得到完整肽段的分子量，mass=(m/z-1)*z

C端肽段一級質(zhì)譜圖

（橫坐標為檢測到的m/z值，縱坐標為相對信號強度）

二級質(zhì)譜圖得到的是肽段的碎片離子m/z值，完整肽段在質(zhì)譜中從肽鍵位置被打碎為碎片離子，靠近肽段的N端的為b離子，靠近C端的為y離子（例如二級圖中的肽段KTSTSPLVKSF, 二級碎裂之后，碎片離子K和TSTSPLVKSF分別為b1和y10離子，碎片離子KT和STSPLVKSF分別為b2和y9離子）。理論的碎片離子m/z與實際二級圖中的檢測值匹配到的越多，可信度越高。通過肽段二級碎裂片段信息確定C端肽段序列

肽段二級質(zhì)譜圖

（橫坐標為檢測到的m/z值，縱坐標為相對信號強度）

實際項目中會至少使用兩種互補的蛋白酶對靶蛋白進行酶切，可以得到兩條長度不同的C端肽段，通過對于兩條C端肽段序列的相互驗證，最終確定蛋白的C端序列信息。

常見典型問題

問題1：蛋白經(jīng)過酶切后會在固定的位點斷開，如何確定C端的肽段就是蛋白C端呢？

回答：數(shù)據(jù)分析的時候會挑選N端為酶切位點而C端不是酶切位點的肽段，保證肽段是酶切形成的而不是隨機的雜質(zhì)肽段，同時保證肽段末端與對比末端是統(tǒng)一的。

問題2：如果分析結(jié)果只有C末端為酶切位點的肽段，如何進步確認C端具體位置？

回答：這種結(jié)果通常是兩種情況造成的。第一種情況是蛋白的C端正好是酶切位點，我們可以通過不同酶切同時分析排除這種情況。第二種是蛋白C端離該酶切位點很近或很遠，酶切之后剩余片段太短或太長，碎裂情況太差，無法被分析軟件識別到，我們可以建立一個梯度數(shù)據(jù)庫，每個序列比上一下序列多一個氨基酸，利用梯度數(shù)據(jù)庫重新比對分析。