寫在前面

????????今天推薦的是由國家蛋白質(zhì)中心在2019年5月15日發(fā)表于Nature Communications（2020IF：14.919，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Huadong Pei教授，研究表明去泛素化酶USP15調(diào)節(jié)同源重組修復(fù)和癌細胞對PARP抑制劑的反應(yīng)。

研究背景

????????聚合酶抑制劑 (PARPi) 選擇性地殺死具有BRCA1/2突變引起的同源重組 (HR) 缺陷的乳腺癌和卵巢癌。也有臨床證據(jù)表明PARPi在無BRCA突變的乳腺癌和卵巢癌中具有一定效用，但潛在機制尚不清楚。

摘要部分

????????在這里，作者報告了去泛素化酶USP15通過調(diào)節(jié)HR影響癌細胞對PARPi的反應(yīng)。從機制上講，USP15被 MDC1 募集到DNA雙鏈斷裂 (DSB)，這需要MDC1的FHA結(jié)構(gòu)域和USP15的磷酸化Ser678。隨后，USP15去泛素化BARD1 BRCT域，并促進 BARD1-HP1γ相互作用，導(dǎo)致BRCA1/BARD1保留在DSB。USP15基因敲除小鼠在體內(nèi)表現(xiàn)出基因組不穩(wěn)定性。此外，與癌癥相關(guān)的USP15突變，隨著USP15-BARD1相互作用的減少，增加了癌細胞中PARP抑制劑的敏感性。因此，作者的結(jié)果確定了一種新的同源重組（HR）調(diào)節(jié)劑，它是在癌癥中使用PARP抑制劑進行治療的潛在生物標志物。

研究內(nèi)容

1.USP15能夠調(diào)節(jié)同源重組

????????作者首先發(fā)現(xiàn)CRISPR對USP15的敲除（KO）使癌細胞對DNA損傷劑敏感。不僅如此，WT USP15的回補抑制了USP15敲除導(dǎo)致的DNA損傷敏感性。為了進一步探究USP15是否在DSB修復(fù)中起作用，作者研究了IR誘導(dǎo)的USP15-KO細胞中γH2AX病灶的形成。USP15的敲除導(dǎo)致自發(fā)γH2AX病灶形成水平升高。此外，與對照細胞相反，在IR后 24小時，USP15的抑制導(dǎo)致持續(xù)的γH2AX病灶，表明USP15有助于DNA損傷修復(fù)。接下來，作者使用HR和 NHEJ56的綜合報告基因檢測研究了USP15如何促進DNA修復(fù)。作者觀察到USP15-KO 細胞中HR顯著受損。相反，作者觀察到NHEJ效率略有增加。USP15 KO還導(dǎo)致對PARP抑制劑的超敏反應(yīng)，表明USP15在HR途徑中的重要作用。

研究結(jié)論：USP15調(diào)節(jié)同源重組 (HR) 和乳腺癌對聚 (ADP-核糖) 聚合酶 (PARP) 抑制劑的反應(yīng)

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2.USP15在DNA末端切除中發(fā)揮作用? ? ?

????????為了檢查USP15在HR中的作用，作者探究了USP15-KO細胞中紫外線 (UV) 激光微輻照誘導(dǎo)的DNA損傷處幾種DDR因子的積累。USP15缺乏導(dǎo)致BARD1、BRCA1、RPA和RAD51的積累受損。相比之下，USP15不影響B(tài)ARD1/BRCA1上游調(diào)節(jié)因子的募集，對DSB的53BP1募集也沒有影響。USP15主要影響B(tài)ARD1/BRCA1在晚期時DSB的保留。先前的研究報告稱，BRCA1缺陷細胞中53BP1的缺失通過恢復(fù)HR效率逆轉(zhuǎn)了它們對PARP抑制劑的敏感性。作者還發(fā)現(xiàn)USP15敲除細胞中53BP1 的敲低恢復(fù)了HR效率，以及PARP抑制劑敏感性。

研究結(jié)論：USP15通過其對BARD1/BRCA1的影響來調(diào)節(jié)DNA末端切除。

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3.USP15通過其C端與BARD1相互作用

????????USP15影響B(tài)ARD1向DSB的募集，作者接下來檢查了USP15是否可以與BARD1相互作用。作者使用針對USP15或BARD1的抗體進行了免疫共沉淀實驗。內(nèi)源性USP15和BARD1在細胞中相互關(guān)聯(lián)。另一方面，在IR、HU、MMC或CPT處理后，USP15-BARD1相互作用增加。USP15的氨基末端包含DUSP結(jié)構(gòu)域，中間包含兩個UBL結(jié)構(gòu)域，以及羧基末端。作者接下來通過在HEK293T細胞中表達BARD1和USP15或其突變體來測試USP15的哪個區(qū)域與BARD1相互作用。USP15缺失突變體消除了USP15與BARD1的結(jié)合。類似地，作者產(chǎn)生了BARD1的缺失突變體。BARD1的USP15結(jié)合區(qū)被定位到C端BRCT域。另一方面，作者證實USP15-BARD1相互作用對于HR和癌細胞對PARP抑制劑的反應(yīng)是必不可少的。

研究結(jié)論：USP15通過其C端區(qū)域與BARD1 BRCT結(jié)構(gòu)域相互作用。

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4.USP15去泛素化BARD1 BRCT結(jié)構(gòu)域??? ?

????????作者用 WT USP15或USP15-C269A突變體在USP15-KO細胞中重新表達。WT USP15而非C269A恢復(fù)了HR和PARP1抑制劑反應(yīng)，也恢復(fù)BRCA1、BARD1、RPA和 RAD51病灶的形成在USP15敲除的細胞中。這些結(jié)果表明USP15的去泛素化酶活性是其在HR中發(fā)揮作用所必需的。由于USP15與BARD1相互作用，作者認為BARD1是USP15的主要靶標。DNA損傷后BARD1泛素化略有下降，而在USP15敲低的細胞中，基礎(chǔ)BARD1泛素化水平?jīng)]有下降。因為BARD1的C端對其在HR中的功能很重要，作者隨后研究了USP15是否在體外和體內(nèi)去泛素化BARD1 BRCT域。作者純化了GST-USP15 WT或GST-USP15C269A突變體，并進行了體外去泛素化試驗。 USP15從BARD1的BRCT域中去除了K63，但不去除K48連接的泛素鏈。有趣的是，BARD1 BRCT域泛素化在DNA損傷后顯著降低。此外，在缺乏USP15的細胞中，BARD1 BRCT域泛素化不再減少。以上結(jié)果表明USP15通過在BRCT域靶向BARD1來調(diào)節(jié)HR。? ? ?

????????由于USP15在DSB上調(diào)節(jié)BARD1/BRCA1保留，作者想闡明潛在的機制。作者首先證實了USP15沒有通過 RAP80起作用。BARD1和poly-PAR之間的相互作用在USP15敲低的細胞中也不受影響。作者還研究了USP15-KO細胞中的BARD1-HP1γ相互作用。敲除USP15降低了細胞中BARD1-HP1γ的相互作用，這種作用取決于USP15去泛素化酶活性。更重要的是，作者通過USP15制備了去泛素化的 BARD1-BRCT結(jié)構(gòu)域，并在體外檢測了它與HP1γ蛋白的相互作用。USP15在體外去泛素化了BARD1 BRCT結(jié)構(gòu)域，并促進了BARD1-HP1γ相互作用。

研究結(jié)論：BARD1在DNA損傷位點的保留是由USP15通過在 BRCT域去泛素化BARD1來調(diào)節(jié)的。

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5.USP15在Ser678處磷酸化并被招募到DSB? ? ?

????????作者接下來探究了USP15本身是否以及如何受到調(diào)控。IR后USP15在共濟失調(diào)毛細血管擴張突變（ATM）共有SQ/TQ位點被磷酸化。在Atm缺陷的小鼠胚胎成纖維細胞 (MEF) 中未檢測到磷酸-SQ/TQ 信號，表明USP15以 ATM依賴性方式磷酸化。之前的研究表明，USP15的Ser678在DNA損傷后被ATM磷酸化。Ser678的突變消除了ATM依賴性USP15磷酸化，表明Ser678是USP15的主要ATM磷酸化位點。? ? ?

????????在DNA損傷之前，USP15分布在細胞核和細胞質(zhì)中，大部分信號在細胞質(zhì)中。IR誘導(dǎo)USP15易位到細胞核。作者接下來想探究USP15磷酸化是否影響其在細胞中的定位。作者發(fā)現(xiàn)磷酸化的USP15被募集到DSB，而通過ATM消除其磷酸化的 S678A突變體不能被募集到DSB。從機制上講，USP15在DNA損傷時與MDC1共定位，并且MDC1的敲低降低了USP15向DSB的募集。更重要的是，USP15與 MDC1相關(guān)，并且這種相互作用在DNA損傷后增加。

先前的研究表明，MDC1包含結(jié)合磷酸SQ/TQ基序的FHA域和BRCT域。作者發(fā)現(xiàn) MDC1-FHA 結(jié)構(gòu)域結(jié)合磷酸化的USP15，并且Ser678磷酸化對于這種結(jié)合是必不可少的。

研究結(jié)論：USP15被ATM磷酸化，并被MDC1募集到DNA損傷位。

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6.USP15磷酸化對其在同源重組中的功能至關(guān)重要

????????先前的研究表明USP15 Ser678在子宮內(nèi)膜癌患者中發(fā)生突變。為了探究USP15磷酸化如何影響細胞對DNA損傷的敏感性，作者用異位表達的WT USP15或USP15 S678A 突變體重建了USP15-KO 細胞。USP15的敲低增加了 PARP抑制劑的敏感性，用WT USP15重新表達可以逆轉(zhuǎn)這種影響。與該結(jié)果一致，WT USP15，而非USP15 S678A 突變體，恢復(fù)了HR效率，以及 BRCA1、BARD1、RPA 和 Rad51 病灶的形成。此外，ATM抑制劑（Ku55933）處理也抑制了DNA損傷時USP15介導(dǎo)的BARD1去泛素化。

研究結(jié)論：USP15磷酸化對其在HR中的功能至關(guān)重要。

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7.USP15-KO小鼠顯示基因組不穩(wěn)定

????????作者在C57BL/6J品系中產(chǎn)生了USP15-KO小鼠。作者發(fā)現(xiàn)USP15-/-小鼠生長遲緩。5個月大的Usp15-/-小鼠的平均體重，與野生型小鼠相比體重減少20%。USP15-/-?MEF顯示出更多的自發(fā)性DNA損傷且具有更多的γH2AX病灶。為了探究USP15表達的喪失是否會使小鼠對IR過敏，所有USP15-/-小鼠在輻照后17天內(nèi)死亡，而70%的USP15+/+和45%的USP15+/-照射后1個月小鼠仍然活著。USP15-/-小鼠組織顯示出更多的γH2AX信號。在細胞層面，Usp15-/-?MEF在IR后 BARD1、RPA和RAD51病灶形成被抑制，并且也對CPT、MMC或AZD2281過敏。作者還探究了USP15+/+和USP15-/-?MEF的中期傳播。未經(jīng)處理的USP15-/-?MEF與野生型MEF相比，顯示自發(fā)的單染色單體斷裂增加了近3倍，表明USP15-/-細胞中基因組穩(wěn)定性存在內(nèi)在缺陷。

研究結(jié)論：USP15在體內(nèi)DSB修復(fù)中發(fā)揮作用。

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8.USP15的癌癥相關(guān)突變導(dǎo)致同源重組缺陷? ? ?

????????先前的研究表明，USP15 Ser678在子宮內(nèi)膜癌患者中發(fā)生了突變。作者證實USP15 S678磷酸化對其在HR和基因組穩(wěn)定性方面的功能至關(guān)重要。作者還根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫癌癥基因組圖譜 (TCGA)調(diào)查了乳腺癌患者中其他潛在的USP15突變。作者在乳腺癌患者的C端D3區(qū)域鑒定了USP15的兩個突變（M861V和D967H）。作者證實該區(qū)域負責BARD1結(jié)合。作者用異位表達的WT USP15或USP15 M861V/D967H突變體重建USP15-KO細胞。WT USP15（而非USP15M861V/D967H 突變體）恢復(fù)了HR效率，以及BARD1、RPA和RAD51病灶的形成。USP15 M861V/D967H 突變體對PARP1抑制劑更敏感。在分子水平上，USP15M861V/D967H 破壞了USP15-BARD1 相互作用并且未能在BRCT域中去泛素化 BARD1。

????????作者接下來研究了USP15在其他癌細胞系中是否失調(diào)。TCGA-ACbC隊列表明USP15基因在16.67%的乳腺癌患者中深度缺失。此外，人胰腺癌細胞系拷貝數(shù)變化的整合分析表明，胰腺癌細胞系中USP15的選擇性下調(diào)。作者還證實USP15在許多胰腺癌細胞系中下調(diào)。

研究結(jié)論：USP15的癌癥相關(guān)突變導(dǎo)致同源重組缺陷。

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結(jié)論與討論

????????作者證明USP15調(diào)節(jié)HR和癌細胞對PARP抑制劑的反應(yīng)。從機制上講， USP15促進了BARD1/BRCA1在DBS的保留，從而促進了DSB末端的切除。因此，USP15對體內(nèi)的DNA損傷修復(fù)至關(guān)重要。此外， USP15C端在乳腺癌患者中發(fā)生突變，破壞了USP15-BARD1的相互作用，導(dǎo)致HR缺陷。因此，USP15加作為影響HR和PARP1抑制劑反應(yīng)的蛋白質(zhì)之一，對控制和調(diào)節(jié)DNA末端切除具有一定的作用。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-09232-8