免疫治療，是繼手術(shù)、放療、化療、靶向治療之后的又一個(gè)抗腫瘤手段，在帶來(lái)部分腫瘤患者長(zhǎng)期治愈的同時(shí)，我們也需要知道，很多患者其實(shí)是無(wú)緣腫瘤免疫治療的。那如何有效進(jìn)行免疫治療獲益人群的細(xì)分，就顯得尤為重要。本文就Nature期刊上最新刊發(fā)的文章，闡述腫瘤和血液中CD8+T細(xì)胞克隆多樣性是免疫治療的關(guān)鍵。

——摘 要——

新抗原是源自可以被抗腫瘤T細(xì)胞識(shí)別的人類(lèi)白細(xì)胞抗原（HLA）的非同義突變的肽段。大量的HLA等位基因多樣性和有限的臨床樣本限制了對(duì)患者治療過(guò)程中新抗原靶向T細(xì)胞反應(yīng)的研究。本文研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用了最近開(kāi)發(fā)的技術(shù)，從轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者（無(wú)論是否對(duì)抗PD-1免疫治療有反應(yīng)）的血液和腫瘤中捕獲新抗原特異性T細(xì)胞，生成了新抗原-HLA個(gè)性化庫(kù)，以單細(xì)胞分離技術(shù)分離T細(xì)胞并克隆其T細(xì)胞受體（neoTCR）。來(lái)自7名具有長(zhǎng)期臨床反應(yīng)的患者的樣本中，具有不同新TCR序列的多個(gè)T細(xì)胞（T細(xì)胞克隆型）識(shí)別出數(shù)量有限的突變。隨著時(shí)間的推移，在血液和腫瘤中反復(fù)檢測(cè)到這些新TCR克隆型。來(lái)自四名對(duì)抗PD-1無(wú)反應(yīng)的患者的樣本也顯示：血液和腫瘤中的新抗原特異性T細(xì)胞對(duì)有限數(shù)量的TCR多克隆性突變的反應(yīng)較低，并且在連續(xù)樣本中沒(méi)有反復(fù)檢測(cè)到。使用非病毒CRISPR–Cas9基因編輯重建供體T細(xì)胞中的新TCRs顯示了對(duì)患者匹配的黑色素瘤細(xì)胞系的特異性識(shí)別和細(xì)胞毒性。因此，有效的抗PD-1免疫療法與腫瘤和血液中存在多克隆CD8+T細(xì)胞有關(guān)，這些細(xì)胞具有有限數(shù)量的免疫顯性突變，隨著時(shí)間的推移，這些突變會(huì)被反復(fù)識(shí)別。即實(shí)際上新抗原特異性的癌癥免疫反應(yīng)針對(duì)的只是數(shù)量有限突變（范圍為3至13）。

研究團(tuán)隊(duì)招募了11名接受過(guò)PD-1抑制劑治療的黑色素瘤患者。其中患者1到患者7從免疫治療中獲得了持久的益處，生存時(shí)間在32個(gè)月到111個(gè)月之間，而且到本研究結(jié)束時(shí)所有患者依然存活；患者8到患者11，對(duì)免疫治療沒(méi)有反應(yīng)，或者治療后病情加重，在研究結(jié)束時(shí)這些患者都已去世。

圖1. 新抗原特異性T細(xì)胞篩選和TCR克隆型鑒定

a. 從患者樣本中分離新抗原特異性TCR的示意圖。NeoAg，新抗原。

b.非同義突變數(shù)量的表示、篩選突變、預(yù)測(cè)新抗原HLA復(fù)合物在對(duì)抗PD-1治療有應(yīng)答（患者1-7）或無(wú)應(yīng)答（患者8-11）的患者中分離的新抗原特異性T細(xì)胞和新抗原特異性T細(xì)胞克隆型靶向的突變。

c.在每個(gè)患者中針對(duì)每個(gè)突變分離的新抗原特異性TCR克隆型的數(shù)量比率。數(shù)據(jù)均為平均值?±?s.d.與單獨(dú)的值。n值表示不同患者的數(shù)量；n?=?7（應(yīng)答者）和n?=?4（無(wú)應(yīng)答者）。

盡管表達(dá)的突變范圍很廣，但T細(xì)胞識(shí)別為新抗原的突變數(shù)量變化較小，從1到13不等（圖1b，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1和補(bǔ)充表1）。因此，有證據(jù)表明免疫顯性，即T細(xì)胞對(duì)突變新抗原的反應(yīng)與突變的數(shù)量沒(méi)有線性關(guān)系，而是針對(duì)一組有限的突變，這些突變?cè)趯?duì)PD-1免疫治療有或無(wú)臨床反應(yīng)的患者中被識(shí)別為新抗原。

圖2. 從具有對(duì)抗PD-1治療有應(yīng)答患者的TIL和PBMC中分離新抗原特異性T細(xì)胞

a. 隨時(shí)間變化的腫瘤測(cè)量和患者1的樣本采集。b.患者1在基線時(shí)（第?12天，左側(cè)）和治療時(shí)（第428天，右側(cè)）的核磁共振成像（MRI）掃描。c.患者1中新抗原特異性T細(xì)胞隨時(shí)間變化的分析。底部，mRNA表達(dá)，以絕對(duì)讀數(shù)測(cè)量，并預(yù)測(cè)篩選的推定新抗原的HLA結(jié)合親和力。T細(xì)胞靶向的新抗原以不同顏色突出顯示，頂部顯示了突變的基因名稱、帶有紅色標(biāo)記的點(diǎn)突變的新抗原序列和HLA。上圖中使用了相同的色碼，以顯示分離的T細(xì)胞的新抗原特異性。六個(gè)頂部面板顯示了TIL和PBMC中新抗原特異性T細(xì)胞隨時(shí)間的演變.每個(gè)方框代表一個(gè)孤立的T細(xì)胞，每個(gè)交叉相當(dāng)于十個(gè)孤立的T細(xì)胞，每個(gè)圓圈相當(dāng)于100個(gè)孤立的T細(xì)胞。每種顏色代表不同的新抗原特異性T細(xì)胞克隆型。使用四舍五入法將分離的T細(xì)胞的數(shù)量歸一化為100000個(gè)CD8+T細(xì)胞以繪制結(jié)果。只有與新抗原HLA結(jié)合的T細(xì)胞克隆型顯示了曾經(jīng)在健康供體T細(xì)胞中表達(dá)的復(fù)合物。d.與a中相同，但適用于患者2。e、 患者2在基線時(shí)（第13天，左側(cè)）和治療時(shí)（第56天，右側(cè)）的計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）。五十、 左；R、 對(duì)。f、 與c中相同，但適用于患者2。g、 與a中相同，但適用于患者6。該患者有兩個(gè)靶病變；示出了最長(zhǎng)直徑的平均值。h、 患者6在基線時(shí)（第?23天，左側(cè)）和治療時(shí)（第84天，右側(cè)）的CT掃描。i、 與c中相同，但適用于患者6。

圖3. 對(duì)于抗PD-1治療有反應(yīng)的患者中分離的新抗原特異性TCRs的抗腫瘤活性

a–g，對(duì)健康供體T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，用來(lái)自患者1（a–c）、患者2（d，e）和患者6（f，g）的分離新TCR替代內(nèi)源性TCR，并用于表征這些新TCR的抗腫瘤活性。每個(gè)TCR的顏色代碼與圖2中每個(gè)T細(xì)胞克隆型的顏色相匹配。a–c，新TCR基因編輯的患者1的T細(xì)胞對(duì)自體細(xì)胞系（M495）和錯(cuò)配對(duì)照（M202）的特異性靶細(xì)胞殺傷（P:T比5:1；n?=?4).地塊分為強(qiáng)殺（a）、中等殺（b）或無(wú)殺（c）的TCR。%nRFP，nRFP陽(yáng)性面積的百分比。d、 4-1BB在與自體（M489）或錯(cuò)配（M202）細(xì)胞系共培養(yǎng)后，患者2的CD8+neoTCR+基因編輯的T細(xì)胞中上調(diào)（n?=?3). e、 自體細(xì)胞系（M489）和錯(cuò)配對(duì)照（M202）中患者2的neoTCR基因編輯T細(xì)胞的特異性靶向細(xì)胞殺傷（P:T比1:1；n?=?4). f、 CD8+新TCR中4-1BB的上調(diào)+與預(yù)處理24小時(shí)的自體（M490）或錯(cuò)配（M202）細(xì)胞系共培養(yǎng)后，患者6的基因編輯T細(xì)胞?γ（n?=?3). g、 自體細(xì)胞系（M490）中neoTCR基因編輯的T細(xì)胞和預(yù)處理24小時(shí)的錯(cuò)配對(duì)照（M202）靶細(xì)胞的特異性靶細(xì)胞殺傷?γ（P:T比10:1；n?=?4).

圖4. 從TIL和PBMC中分離新抗原特異性T細(xì)胞，以及對(duì)抗PD-1無(wú)反應(yīng)的患者的新TCR抗腫瘤活性

a–c，患者9（a）、10（b）和11（c）的新抗原特異性T細(xì)胞分析。底部，mRNA表達(dá)，以絕對(duì)讀數(shù)測(cè)量，并預(yù)測(cè)篩選的推定新抗原的HLA結(jié)合親和力。T細(xì)胞靶向的新抗原以不同的顏色突出顯示?；颊?中預(yù)測(cè)的HLA與新抗原的結(jié)合親和力用箭頭突出顯示，因?yàn)樵摫磉_(dá)被認(rèn)為是陰性的。頂部面板使用相同的顏色代碼，以顯示分離的T細(xì)胞的新抗原特異性。每個(gè)小盒子代表一個(gè)孤立的T細(xì)胞。每種顏色代表不同的新抗原特異性T細(xì)胞克隆型。使用四舍五入法將分離的T細(xì)胞的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)化為100000個(gè)CD8+T細(xì)胞。僅顯示了在健康供體T細(xì)胞中表達(dá)后與新抗原HLA復(fù)合物結(jié)合的T細(xì)胞克隆型。與自體（分別為M488、M485和M486）或錯(cuò)配（M202）細(xì)胞系共培養(yǎng)后，分別來(lái)自患者9（d）、10（e）和11（f）的CD8+neoTCR+基因編輯的T細(xì)胞中的d–f、4-1BB上調(diào)（n?=?3). g–i，來(lái)自自體細(xì)胞系中患者9（g）、10（h）和11（i）的neoTCR基因編輯的T細(xì)胞和不匹配對(duì)照組的特異性靶細(xì)胞殺傷（P:T比5:1，n?=?4例（患者9和10）；和P:T比10:1，n?=?3（患者11））。使用帶有Holm–Sidak調(diào)整的雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)計(jì)算P值，以進(jìn)行與Neo12（e，f，h，i）的多重比較，以及與Neo12的雙尾未配對(duì)t檢驗(yàn)（d，g）*P?< 0.05，***P<0.005，***P<0.0005，***P<0.0001。補(bǔ)充信息中提供了準(zhǔn)確的P值。n值表示生物復(fù)制的數(shù)量。數(shù)據(jù)均為平均值?±?s.d.與單個(gè)值（d–f）和平均值（g–i）。所有T細(xì)胞產(chǎn)物都含有CD8+和CD4+基因編輯的T細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)

Nature. 2023 Mar 8. doi: 10.1038/s41586-023-05787-1. Epub ahead of print. PMID: 36890230.