神經炎癥，即為神經組織的炎癥，是對各種外源性和內源性刺激的反應，包括入侵病原體、神經元損傷和有毒化合物。小膠質細胞作為中樞神經系統(tǒng)（CNS）中的常駐免疫細胞介導神經炎癥，在各種生理和病理條件下發(fā)揮重要作用。當神經元損傷后，小膠質細胞會迅速啟動炎癥反應。已有研究表明代謝相關酶在神經炎癥的調節(jié)中發(fā)揮重要作用，ACSL4恰好是一種脂質代謝調節(jié)酶，ACSL4是否對LPS刺激后小膠質細胞的炎癥反應產生影響尚未可知。

2023年2月11日，青島大學神經再生與神經康復研究所崔玉作為通訊作者在Brain Behavior and Immunity （IF=19.227）發(fā)表了題為“ACSL4 promotes microglia-mediated neuroinflammation by regulating lipid metabolism and VGLL4 expression ”的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)ACSL4通過調節(jié)脂質代謝和VGLL4表達促進小膠質細胞介導的神經炎癥。值得注意的是，在本研究中，作者使用了漢恒提供的慢病毒成功實現(xiàn)了ACSL4的敲低。

為了確定ACSL4是否參與LPS誘導的神經炎癥，作者檢測了經LPS刺激的原代小膠質細胞中ACSL4的表達，結果顯示，LPS刺激2小時后，ACSL4 mRNA的表達顯著增加，LPS刺激后ACSL4的蛋白質水平增加。這些結果表明，LPS刺激后原發(fā)性小膠質細胞中ACSL4的表達增加。

圖1 LPS刺激后小膠質細胞中ACSL4的表達增加

為了評估ACSL4對小膠質細胞介導的炎癥的影響，作者用特異性靶向ACSL4D的siRNA轉染小鼠小膠質細胞，然后檢測LPS刺激后促炎細胞因子的產生情況。qRT-PCR和蛋白質印跡結果均驗證了ACSL4的成功敲低。通過ELISA測定，與siNC轉染的細胞相比，LPS刺激后，沉默ACSL4降低了BV2小膠質細胞中TNFA、IL-6和IL-1b的mRNA水平。因此，敲低ACSL4減少了LPS刺激的促炎細胞因子的產生。

圖2 ACSL4的敲除導致炎性細胞因子的產生減少

為了研究ACSL4促進LPS觸發(fā)的炎癥細胞因子產生的潛在分子機制，作者在小膠質細胞中敲低ACSL4后，分析了TLR4信號激活的關鍵下游信號分子的水平。值得注意的是，與siNC轉染的對照相比，在敲低ACSL4后，LPS誘導的BV2小膠質細胞中NF-κB亞基P65的磷酸化顯著降低。表明，ACSL4沉默細胞中促炎細胞因子的表達減少可能是NF-κB信號激活減少的結果。

圖3 ACSL4通過促進NF-κB信號轉導的方式增加細胞因子的產生

?作者隨后進行了RNA測序，以研究其作用的潛在分子機制。發(fā)現(xiàn)在ACSL4敲低的小膠質細胞中，轉錄調節(jié)因子VGLL4的表達增加，這引起了作者的注意。為了確定ACSL4是否通過降低VGLL4表達來促進炎癥細胞因子的產生，作者用特異性靶向ACSL4和VGLL4的siRNA轉染小鼠BV2細胞，然后測量LPS誘導的促炎細胞因子的生成。值得注意的是，在VGLL4沉默后，ACSL4敲低的小膠質細胞中炎性細胞因子表達的減少在很大程度上恢復；此外，ACSL4敲低的小膠質細胞中NF-κB p65的磷酸化減少得到部分挽救。這些結果表明，ACSL4可能通過降低VGLL4的表達來促進炎癥細胞因子的產生。

圖4 ACSL4通過增加VGLL4的表達調節(jié)炎癥細胞因子的產生

?作者評估了敲低ACSL4是否會改變LPS刺激后的脂質代謝。在敲低ACSL4后，磷脂（PE、PC、PA、PI和PG）、鞘脂（Ger、SM）和脂肪酸（FA）種類的水平顯著降低。此外，觀察到某些脂質亞類水平的特定差異，例如，大多數(shù)含有PUFA的磷脂酰膽堿（PC）和磷脂酸（PA）。這些結果表明，ACSL4可能通過調節(jié)BV2小膠質細胞的脂質組成來調節(jié)炎癥過程。

圖5 敲低ACSL4改變LPS刺激后細胞中的脂質組成

?為了探討ACSL4是否在體內神經炎癥中發(fā)揮重要作用，作者首先通過腹腔注射LPS建立了動物模型，隨后評估了炎癥反應。將慢病毒特異性注射到小鼠的黑質區(qū)域以敲低ACSL4，并在慢病毒注射后兩周給予單劑量LPS（5mg/kg，腹腔注射）刺激。結果顯示，與shNC注射組相比，ACSL4 shRNA在體內的遞送顯著降低了LPS誘導的小膠質細胞活化，表現(xiàn)為更長的分支長度、更高的分支點數(shù)量和更低的反應表型。此外，qRT-PCR分析顯示，與對照小鼠的相應切片相比，ACSL4注射切片中TNFα、IL-6和IL-1β的產生減少。因此，敲低ACSL4在體內減弱了LPS誘導的神經炎癥。

圖6 ACSL4敲低減輕LPS和MPTP誘導的體內神經炎癥

綜上所述，在本研究中發(fā)現(xiàn)LPS刺激后ACSL4的表達上調，敲低ACSL4通過抑制NF-κB的活化來降低促炎細胞因子的表達。有趣的是，ACSL4通過調節(jié)轉錄輔因子VGLL4的表達和降低脂質代謝率來促進細胞因子的產生。此外，敲低ACSL4在體內減弱了LPS誘導的神經炎癥。