上一講啰哩吧嗦地給大家講了一下甲基化檢測技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)，從今天開始我們詳細(xì)地把前面一講提到的各種技術(shù)方法一一展現(xiàn)給大家。這一講，我們先來認(rèn)識(shí)一下焦磷酸測序（pyrosequencing）技術(shù)。

自從Sanger測序法誕生起，大規(guī)模地檢測DNA序列信息就變得可行了，但這里還存在幾個(gè)問題，比如對于多聚核苷酸序列（一堆TTTTTTT或者GGGGGG……這種）的準(zhǔn)確識(shí)別就是一個(gè)問題，此外還有甲基化。我們知道甲基化的核苷酸本身其序列信息并未改變，這樣普通的Sanger測序就也沒辦法識(shí)別它了。

好在有了焦磷酸測序技術(shù)，它是由Nyren等人在1987年發(fā)明出來的一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術(shù)，它能夠很好地彌補(bǔ)普通Sanger測序的不足，進(jìn)行多聚核苷酸及甲基化的檢測，也能檢測SNP突變等。

焦磷酸測序，顧名思義，就是指每次隨著新的dNTP加入，反應(yīng)都會(huì)產(chǎn)生一個(gè)焦磷酸（PPi）分子。它的具體原理是：

??? 引物與模板DNA退火；

??? 在四種酶（DNA 聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶）的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，并生成焦磷酸；

??? 通過檢測每次反應(yīng)所釋放熒光信號的強(qiáng)度，即可實(shí)時(shí)測定DNA序列的構(gòu)成。

這樣，最后我們根據(jù)加入的核苷酸序列及得到的峰圖，即可從順序及峰的面積來讀取待測的序列信息了。

在檢測甲基化時(shí)，我們要先做亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，將甲基化的胞嘧啶C保留，而未甲基化的C則最終變成了T，這樣就可以在測序時(shí)將其分辨出來了。

下面我們來看一下想做焦磷酸測序，具體的步驟應(yīng)該是什么。

????假設(shè)有個(gè)朋友叫小A，找到普鯨君想做焦磷酸測序，普鯨君首先要看小A的待測位點(diǎn)有多少，比如是整個(gè)約2.5kb的promoter區(qū)還是幾個(gè)CG位點(diǎn)？若是全長promoter區(qū)則不劃算了，不如縮小到500bp范圍測一下。

????確定了待測范圍，就要開始做焦磷酸測序的引物評估了，這時(shí)就要問小A待檢測的樣本是什么類型？比如是全血還是FFPE？或者是新鮮組織抑或細(xì)胞？因?yàn)椴煌臉颖绢愋推湟镌O(shè)計(jì)方法也不同的。

????引物設(shè)計(jì)評估好了，就可以去合成了，然后小A的樣本也要保證一定的質(zhì)量，譬如濃度最好能夠達(dá)到30ng/μl的水平。雖然再低一些也可以檢測，但成功率就會(huì)偏低一些，因此在條件允許的前提下樣本濃度還是高一些的好。此外還有純度（OD≈1.8）和體積（>30μl）的要求。

????做好這一切，就可以上機(jī)測序了。

現(xiàn)在焦磷酸測序的生意幾乎是Qiagen一家獨(dú)大了，它們推出了PyroMark Q24、Q48、Q96等一系列產(chǎn)品。我們可以根據(jù)需要來選用合適的機(jī)型，比如現(xiàn)在比較常規(guī)的是PyroMark Q96，而Q48則相對新型一些，它的測序長度更長，input量更低，還能測更多DNA結(jié)構(gòu)等。

好了，今天就介紹到這里了，如果大家有做焦磷酸測序的需要，記得聯(lián)系普鯨君哦！