Cell Biolabs艾美捷QuickTiter逆轉(zhuǎn)錄病毒定量試劑盒提供了一種測定逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的快速方法。該測定法測量逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒核酸含量，可以在純化病毒之前或之后進行。

?

試劑的制備：

?1X QuickTiter? 解決方案C：準(zhǔn)備1X QuickTiter? 溶液C通過稀釋提供的2X在去離子水中以1:2儲存。將稀釋的溶液儲存在室溫下。

?1XCyQuant?GR染料：根據(jù)需要估算1XCyQuant?GR染料的用量包括逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的測定數(shù)量。在使用前立即準(zhǔn)備1XCyQuant?GR染料，方法是在1X TE中以1:400稀釋提供的400X儲備液。為了獲得最佳效果稀釋溶液應(yīng)與其制備2小時一起使用。

?

Cell Biolabs艾美捷QuickTiter??逆轉(zhuǎn)錄病毒定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：

1.從200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，…0創(chuàng)建逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品

μg/mL（1:2連續(xù)稀釋），標(biāo)記九個微量離心管1～9。

2.加入20μL1X QuickTiter? 溶液C至＃2至＃9管，轉(zhuǎn)移20μL200μg/mL?QuickTiter? 逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品到＃1和＃2管。將＃2管混合，轉(zhuǎn)移20μL?混合物（100μg/mL）到下一個試管中。重復(fù)通過tube＃8的步驟，并使用tube＃9作為空白。

3.將5μL每種稀釋液（包括空白）轉(zhuǎn)移至適用于熒光計的微量滴定板。添加向每個包含5μL樣品的孔中加入95μL 1XCyQuant?GR染料。讀盤子使用480/520 nm濾光片組的熒光讀板器。

?

Cell Biolabs艾美捷QuickTiter??逆轉(zhuǎn)錄病毒定量試劑盒測定方案：

1.用所需方法在包裝細胞系中產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒。

2.將病毒樣品（最多2 mL）加入微量離心管中，并將最終體積調(diào)節(jié)至2 mL

完整的培養(yǎng)基，如含有10%FBS的DMEM。

注意：為了準(zhǔn)確定量，必須包括適當(dāng)?shù)年幮詫φ铡Ｊ褂孟嗤?/p>

未轉(zhuǎn)染或模擬轉(zhuǎn)染的包裝細胞培養(yǎng)基上清液的體積。

3.加入10μlQuickTiter? 溶液A到測定管中并通過將管倒置幾次來混合

時代。在37oC孵育30分鐘。

4.加入20μLQuickTiter? 逆轉(zhuǎn)錄病毒溶液B1，通過倒置混合。立即加入20μL

QuickTiter? 逆轉(zhuǎn)錄病毒溶液B2并通過倒置混合。在37oC孵育30分鐘。

5.12000 g離心10分鐘。小心取出并丟棄上清液。去除

最后一位液體，再次以12000 g離心管30秒，然后除去剩余的液體

上清液用小口徑移液器吸頭避免吸出沉淀。

6.加入20μL1X QuickTiter? 溶液C溶解沉淀，渦旋混合10分鐘

秒。

7.以12000g離心5分鐘。將5μL上清液轉(zhuǎn)移至適合于

熒光計。將95μL新制備的1XCyQuant?GR染料加入含有5μL的孔中

上清液。使用480/520 nm濾光片組，用熒光讀板器讀板。

8.?根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度

?

結(jié)果示例

下圖顯示了典型的定量結(jié)果。應(yīng)該使用下面的數(shù)據(jù)僅限參考。這些數(shù)據(jù)不應(yīng)該用來解釋實際結(jié)果。

圖：逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。QuickTiter? 逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品為按照上述說明進行稀釋。熒光測量是在SpectraMax Gemini XS熒光計（分子器件），具有485/538 nm濾光片組和530 nm截止。