本期與您分享的是：新型24-去羥基甾醇還原酶（DHCR24）抑制劑的虛擬篩選及伊貝沙坦降膽固醇作用的生物學評價。AbMole（http://www.abmole.cn/）精研抑制劑十余年，最新的科研動態(tài)不斷與您分享。

高脂血癥是脂肪肝和動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病的危險因素，因此，降膽固醇被認為是預防心血管疾病的重要和有效的手段。3β-羥基甾醇-?（24）-還原酶（DHCR24）催化去脂甾醇向膽固醇的轉(zhuǎn)化，這是膽固醇生物合成途徑的最后一步。我們推測阻斷DHCR24的催化活性可能是治療高脂血癥的一種新的策略。

在本研究中，通過虛擬篩選DrugBank數(shù)據(jù)庫并進行分子動力學模擬分析，選擇了四種潛在的DHCR24抑制劑候選化合物：伊貝沙坦、利培酮、托伐普坦和考尼伐坦。所有四種候選化合物在HepG2細胞中均表現(xiàn)出顯著的降膽固醇活性。高脂血癥的實驗小鼠模型表明，所有四種候選化合物都改善了高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的高血脂水平和脂肪液泡化。

此外，Western blot分析結(jié)果表明伊貝沙坦通過下調(diào)低密度脂蛋白受體的表達來降低膽固醇水平。免疫復合物活性測定證實伊貝沙坦對DHCR24酶活性有抑制作用，其半最大抑制濃度（IC50）值為602 nM。

據(jù)我們所知，這是第一個報告通過競爭性抑制來阻斷DHCR24酶活性的研究，是開發(fā)新的抗高脂血癥或多種癌癥的降膽固醇藥物的潛在策略?？紤]到伊貝沙坦目前用于高血壓合并2型糖尿病，我們認為伊貝沙坦應該是高血壓和高脂血癥的合適選擇。

Conivaptan（Abmole，M5166，純度>99%）
https://www.abmole.cn/products/conivaptan-hydrochloride.html

考尼伐坦是一種非肽段類的 vasopressin receptor 拮抗劑，能夠抑制大鼠肝臟的 V1A 受體和腎臟的V2受體，Ki 值分別為0.48和3.04 nM。

采用分子動力學模擬方法進一步研究了四種候選化合物及DHCR24-FAD配合物的動力學性質(zhì)。結(jié)果與去氨甾醇-DHCR24-FAD復合物的結(jié)果進行了比較。蛋白質(zhì)-配體復合物的均方根偏差（RMSD）在12 ns后保持穩(wěn)定（圖2A）。然后利用分子力學-廣義玻恩表面積（MM-GBSA）方法截取平衡構(gòu)象，計算各體系的結(jié)合自由能。與DHCR24+FAD+DES體系相比，DHCR24+FAD+IRB或DHCR24+FAD+CON體系具有更強的負結(jié)合能，表明考尼伐坦或伊貝沙坦對DHCR24的抑制效果更好。為了研究結(jié)合模式，我們截取了分子動力學模擬結(jié)果的最后一幀，并將DHCR24+FAD+DES體系分別與DHCR24+FAD和四個候選藥物體系進行比對（圖2B）。

結(jié)果表明，考尼伐坦并沒有與去氨甾醇與DHCR24結(jié)合在同一個口袋上，而是在其活性口袋周圍結(jié)合，這表明它可能通過阻止生理底物去氨甾醇進入活性口袋來抑制酶的活性。伊貝沙坦在DHCR24蛋白結(jié)構(gòu)中的結(jié)合位置與去脂甾醇與DHCR24的結(jié)合位置相同。利培酮或托伐普坦與DHCR24蛋白的結(jié)合位置與底物去脂甾醇的結(jié)合位置略有偏離。

這些結(jié)果表明伊貝沙坦可以通過競爭性抑制更好地阻斷DHCR24催化劑在膽固醇合成中的活性，而其他三種候選抑制劑的效果略差。

用指定的候選藥物刺激HEPG2細胞后，采用filipin染色法測定細胞膽固醇含量。細胞邊界處的熒光強度強于細胞其他部位，說明細胞膜中的膽固醇含量較高（圖4A,B）。與細胞膜膽固醇含量最高的理論相一致。與S（+）和S（-）組相比，對照組（U18666A）和4個藥物組的熒光強度顯著降低，說明這些小分子候選藥物可以抑制膽固醇合成，從而降低細胞內(nèi)膽固醇含量。

利用Image-J分析各圖像的相對熒光強度比（圖4B）。與S（+）和S（-）組相比，U18666A和4種候選藥物對HepG2細胞的膽固醇含量顯著降低，表明虛擬篩選得到的4種藥物具有抑制DHCR24活性和降低膽固醇的功能。HepG2細胞藥物處理后，采用HPLC法檢測膽固醇含量的變化（圖4C）。

在所有組中，細胞中的膽固醇含量降低到HPLC檢測不到的非常低的水平。這些數(shù)據(jù)證明，這四種候選藥物在細胞水平上對DHCR24活性的抑制和膽固醇含量的降低具有實質(zhì)性的作用。

采用高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠，建立小鼠高脂血癥模型。飼養(yǎng)4周，每周記錄體重變化（圖5A）。小鼠血清參數(shù)分析顯示，與溶劑對照組（CMC-Na）相比，利培酮組和伊貝沙坦組小鼠血清總膽固醇（TC）水平降低，伊貝沙坦組、考尼伐坦組和托伐普坦組小鼠血清LDL-C含量降低。各組大鼠血清總甘油三酯（TG）含量均升高，血清HDL-C含量均降低。IRB組血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和LDL-C顯著降低，HDL-C升高，這與分子動力學模擬結(jié)果一致（圖5B）。

肝組織HE染色結(jié)果顯示，與正常飲食小鼠（ND）相比，高脂肪模型載藥對照組CMC-Na組小鼠的肝組織顯示出更大的肝細胞和細胞內(nèi)聚集的脂質(zhì)。同時，脂質(zhì)分散在細胞質(zhì)中，細胞核被擠壓到邊緣，并有明顯的空泡形成，證明高脂喂養(yǎng)小鼠成功建模。與高脂組相比，伊貝沙坦組、利培酮組、托伐普坦組和考尼伐坦組小鼠肝細胞體積變小，脂質(zhì)空泡化減少。在辛伐他汀治療的陽性對照中也觀察到這些改善的表型。

這些結(jié)果表明，這四種藥物都能改善高脂小鼠的高脂血癥癥狀。根據(jù)小鼠血清生化指標的結(jié)果，伊貝沙坦在四種候選藥物中表現(xiàn)明顯更好（圖5C）。

鳴謝：Haozhen Wang, et al. Molecules. 2023 Mar 14;28(6):2643.