細胞因子是由免疫細胞（如單核、巨噬細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等）和某些非免疫細胞（內皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等）經刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質。

細胞因子一般通過結合相應受體調節(jié)細胞生長、分化和效應，調控免疫應答。這些細胞因子的種類很多，包括腫瘤壞死因子—α(TNF-α)、白介素—1β(IL-1β)、白介素—6(IL-6)、轉化生長因子—β(TGF-β)等。

研究細胞因子為臨床上疾病的預防、診斷、機理研究以及治療等奠定了良好的基礎，應用前景非常廣泛。

目前檢測細胞因子的方法有很多，根據(jù)檢測原理和手段的不同，檢測技術大致可分為四類：免疫學方法、生物學方法、分子生物學方法及質譜法。

本篇內容我們就和大家一起來匯總一下10種方法的技術原理及方法特點：

一、7種基于免疫學的常用的細胞因子檢測方法

Western Blot法
酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）
酶聯(lián)免疫斑點技術（ELISpot）
超敏電化學發(fā)光技術（MSD）
Luminex液相芯片檢測技
Olink技術
Simoa技術（Simoa）

二、2種基于生物學的檢測方法

反轉錄·聚合酶鏈反應（RT-PCR）
Cytometric Bead Array（CBA）系統(tǒng)

三、質譜法

四、12項細胞因子檢測的臨床意義

一、基于免疫學的檢測方法

炎癥因子作為一種蛋白質抗原，可以特異性與其單克隆抗體結合，利用抗原抗體反應檢測細胞因子，近年來發(fā)展比較快，其方法包括Western Blot法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、酶聯(lián)免疫斑點技術、超敏電化學發(fā)光技術、Luminex液相芯片檢測技術、Olink技術、Simoa技術。

1）Western Blot（WB）

Western Blot（WB），就是大家熟知的蛋白質印跡法、免疫印跡實驗。是一種常規(guī)的蛋白分析技術，常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。WB實驗的基本核心理念是抗原抗體的特異性反應，通過變性膠SDS-PAGE將不同分子量的蛋白質分離開，然后轉移到固相載體硝酸纖維素薄膜（NC）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，再用脫脂牛奶作為封閉液進行封閉和一抗稀釋液進行稀釋。待目的蛋白和抗體充分結合后，用洗脫液洗脫掉多余未結合的一抗，加入帶有標記的對應二抗，這樣，目的蛋白+一抗+二抗形成一個復合物，加以化學發(fā)光液，有靶蛋白的位置就會產生熒光，利用膠片或者化學發(fā)光儀就可以顯現(xiàn)靶蛋白的條帶顯現(xiàn)。

2）ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA），酶聯(lián)免疫吸附測定法，是將抗原、抗體的免疫反應和酶的高效催化反應有機結合而發(fā)展起來的一種綜合性技術。固定在載體表面的抗原或者抗體不會失活，仍然保留其免疫反應性。酶標記的抗體或者抗原既具有免疫學活性，還具有酶的催化活性。在實際檢測時，首先將抗原或者抗體固定在固相載體上。然后加入檢測對象，讓待測物質與固相化物質結合，形成固相化的“抗原—抗體”復合物。再加入酶標記的抗體或者抗原，與固相化的復合物結合，形成酶標復合物。最后加入底物溶液，發(fā)生酶催化底物顯色反應，根據(jù)顏色深淺進行定性或定量分析。

3）ELISpot

Enzyme Linked Immunospot Assay（ELISpot），酶聯(lián)免疫斑點技術，細胞受到刺激后局部產生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子，通過ELISpot酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結果。該技術可以在單細胞水平對抗體分泌細胞及細胞因子分泌細胞進行檢測，能從20萬-30萬細胞中檢岀1個分泌該蛋白的細胞。該方法關注的結果是分泌細胞的比率（等于陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)）。主要用于疫苗、細胞治療、基因治療等領域，是研究T細胞免疫原性反應的主要檢測方法。

ELISpot通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下或通過儀器對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。而ELISA則通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。該方法的樣本要求是活細胞，其中細胞存活率最好不低于80%，如果能達到90%以上更好。

4）Meso Scale Discovery（MSD）

Meso Scale Discovery（MSD）超敏電化學發(fā)光技術，基于石墨微孔板的電化學發(fā)光免疫分析是根據(jù)ELISA基本原理的升級，在板底通電從而激發(fā)標記物SULFO-TAG發(fā)光并由CCD Camera進行信號采集。主要基于超敏多因子電化學發(fā)光分析儀MESO Sector 600或Quickplex SQ 120。通過點陣技術，在96孔石墨電極板里可實現(xiàn)10個指標每孔的檢測。也可在24孔板里定制實現(xiàn)100指標/孔的篩選檢測。

5）Luminex液相芯片檢測技術

該技術是結合微球和流式細胞儀的原理來檢測蛋白的一種方法，核心是將聚丙乙烯微球或者磁性微球用熒光染料的方法進行編碼，通過調節(jié)兩種熒光染料的不同配比獲得最多100種具有不同熒光光譜的微球，每種微球共價交聯(lián)上針對特定抗原的捕獲抗體。應用時，先將針對不同檢測物的微球混合，加入待測樣本后，靶分子與微球表面的捕獲抗體特異結合，每個反應孔中可同時完成最多100種檢測反應。上機時儀器通過兩束激光分別識別微球的編碼和微球上報告分子的熒光信號強度，熒光強度反應微球結合的靶標蛋白的含量，這一步用于定量。因此，利用微球技術，可以同時檢測多個蛋白。

6）Olink平臺

該平臺是基于臨近延伸分析（PEA）技術，通過一對特異性抗體結合識別靶蛋白，這對抗體分別偶聯(lián)DNA寡核苷酸標記，當結合在同一蛋白上的兩個抗體相互靠近時DNA寡核苷酸互補配對并結合DNA聚合酶進行擴增。最后，使用qPCR或二代測序技術定量DNA寡核苷酸，通過特異性的核苷酸序列信號來反應檢測蛋白質的含量。

7）分子免疫陣列技術

該技術（single molecule array，Simoa）是基于微陣列芯片的單分子免疫檢測，是在毫米級芯片上雕刻（或澆筑）成千上萬個微米級微井，每個微井體積約40 fl左右，隨后將免疫復合物磁珠分配于微井中，再借助高分辨率熒光顯微鏡對熒光點進行計數(shù)，依據(jù)泊松分布理論，計算同時含珠子與熒光產物孔的數(shù)量/含珠子孔總數(shù)的比值，以此確定測試樣品中的蛋白質濃度。

二、基于分子生物學方法

主要是檢測細胞因子的基因表達水平，包括對其DNA的檢測和mRNA表達水平的檢測。對于表達低或者體內只能得到數(shù)量極少的細胞產生的細胞因子，因其含量太低，免疫學和生物學方法難以測定，常用的方法有Southern印跡、斑點印跡、PCR，原位雜交及原位PCR等，Northern印跡及RT-PCR。這里簡要介紹常見細胞因子mRNA表達水平的檢測。

1）反轉錄·聚合酶鏈反應（RT-PCR）

即將RNA的反轉錄（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。細胞因子的mRNA壽命短且拷貝數(shù)低，因此難以在小量樣本中進行檢測。RT-PCR是一種能檢測細胞內低豐度特異RNA的方法，其原理是首先以RNA為模板，在逆轉錄酶的催化下，合成與RNA互補的cDNA。然后已cDNA為模板，用PCR技術對靶序列進行擴展，使微量細胞因子的RNA經放大后檢出。

該方法尤其適用于含量極少或容易降解的細胞因子，無視樣本類型，只需要設計好相對性的擴增引物及探針。但易出現(xiàn)假陽性和假陰性，在實驗中必須設嚴格的對照實驗。且測定結果只能代表細胞因子基因的表達，而不能代表活性細胞因子的水平，并且不容易對細胞因子表達水平進行定量。

2）Cytometric Bead Array（CBA）系統(tǒng)

即流式編碼微球芯片技術，又稱細胞因子微球檢測技術，是用流式細胞儀對多重蛋白進行定量檢測的方法，能夠同時對樣本中的多個指標進行定性、定量檢測，可應用于細胞因子檢測。目前CBA檢測系統(tǒng)采用聚苯熒光編碼微球（有磁性/非磁性）連結特定的捕獲抗體，捕捉待測物，同時再加入待測物的熒光抗體，三者形成夾心復合物，通過流式細胞儀進行檢測。

CBA法的優(yōu)點是同時可以進行多參數(shù)檢測，快速并且信息量大，其優(yōu)勢體現(xiàn)在能夠同時對單個樣本進行多種檢測，所需樣本量少、靈敏度高、穩(wěn)定性好等。

以上我們介紹了2種基于流式細胞術技術的細胞因子檢測方法，差異對比見下表：

三、質譜法

即用電場和磁場將運動的離子（帶電荷的原子、分子或分子碎片）按它們的質荷比分離后進行檢測的方法。因為質譜儀器的種類多，應用范圍廣，其檢測靈敏度極高，但目前主要用于細胞因子檢測的方法有待進一步開發(fā)，市面上主要存在靶向蛋白質組學（PRM）方法和非靶向蛋白質組學方法，PRM檢測法最多一次可檢測50種蛋白質進行絕對/相對定量，非靶向蛋白質組學方法最多一次可檢測多達數(shù)千種蛋白質進行絕對/相對定量，但重復性稍差，要嚴格控制操作條件。此外，生物樣品的前處理方法跟檢測結果的準確性息息相關。

四、12項細胞因子檢測的臨床意義

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