膀胱癌(BCa)是泌尿系統(tǒng)主要惡性腫瘤之一，在2022年造成17100人死亡。晚期BCa患者的主要治療措施是順鉑化療，但幾個(gè)月后會(huì)出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，了解BCa惡性表型和化療耐藥的深層調(diào)控機(jī)制對制定BCa治療策略的至關(guān)重要。一些臨床研究發(fā)現(xiàn)限制甲硫氨酸和化療聯(lián)合使用能獲得了很好的預(yù)后結(jié)果。過去對甲硫氨酸限制的臨床前研究和臨床試驗(yàn)只關(guān)注于癌細(xì)胞，而忽略了調(diào)節(jié)甲硫氨酸代謝的預(yù)期。因此，有必要進(jìn)一步揭示甲硫氨酸的代謝特征及順鉑耐藥性。

2023年8月，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院姜昊文教授研究團(tuán)隊(duì)的楊宸主治醫(yī)師在期刊Cell Death and Disease (IF 9.0)上發(fā)表了題為“Methionine orchestrates the metabolism vulnerability in cisplatin resistant bladder cancer microenvironment”的文章。該研究團(tuán)隊(duì)利用4D-Label free蛋白組學(xué)結(jié)合代謝組學(xué)，揭示膀胱癌順鉑耐藥性機(jī)制。中科新生命為該研究提供了4D-Labelfree蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)服務(wù)及聯(lián)合分析。

?研究材料

人和鼠膀胱癌細(xì)胞SV-HUC-1、RT4、UM-UC-3、T24、5637、MB49。膀胱癌根治性膀胱切除術(shù)的90對正常和惡性組織

?技術(shù)路線

步驟1：多組學(xué)分析BCa細(xì)胞的順鉑耐藥表型依賴于甲硫氨酸代謝；

步驟2：甲硫氨酸代謝通過改善細(xì)胞干性促進(jìn)BCa的順鉑耐藥；

步驟3：circARHGAP10是一種在順鉑耐藥BCa細(xì)胞中通過調(diào)控MAT2A介導(dǎo)的與甲硫氨酸代謝相關(guān)的circRNA；

步驟4：circARHGAP10通過泛素/蛋白酶體依賴性降解與MAT2A相互作用并破壞其穩(wěn)定；

步驟5：circARHGAP10促進(jìn)E3連接酶TRIM25與MAT2A相互作用，增強(qiáng)MAT2A泛素化。

?主要內(nèi)容

1. 多組學(xué)分析BCa細(xì)胞的順鉑耐藥表型依賴于甲硫氨酸代謝

研究團(tuán)隊(duì)對T24細(xì)胞和T24-CR細(xì)胞進(jìn)行代謝組學(xué)分析，尋找BCa獲得順鉑耐藥性后的差異代謝產(chǎn)物。在164種顯著失調(diào)的代謝產(chǎn)物中(圖1A)，確定了T24-CR細(xì)胞中與氨基酸代謝相關(guān)的16種下調(diào)代謝和50種上調(diào)代謝(圖1B)。GSEA分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了T24-CR細(xì)胞中的幾種代謝途徑，如谷氨酰胺代謝和碳代謝(圖1C)。T24細(xì)胞與T24-CR細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MAT2A在T24-CR細(xì)胞中高表達(dá)(圖1D，E)。還發(fā)現(xiàn)T24-CR細(xì)胞中甲硫氨酸代謝的富集情況(圖1F)。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，在這些代謝途徑中，只有甲硫氨酸代謝的關(guān)鍵酶MAT2A在T24-CR細(xì)胞中上調(diào)，這表明甲硫氨酸代謝對順鉑耐藥至關(guān)重要。在T24-CR細(xì)胞中，甲硫氨酸和SAM富集，而SAH下調(diào)，這意味著T24-CR細(xì)胞中甲硫氨酸的整體循環(huán)和甲基化反應(yīng)增強(qiáng)，為表觀遺傳調(diào)控提供了必需的甲基供體。作為甲硫氨酸代謝的副產(chǎn)物，谷胱甘肽在T24-CR細(xì)胞中也被上調(diào)(圖1D)。代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的一致性分析表明，富集通路具有相對較好的相關(guān)性，這表明兩個(gè)組學(xué)在順鉑耐藥膀胱癌細(xì)胞中具有完美的相關(guān)性(圖1G)。通過對蛋白質(zhì)和代謝的綜合多組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸代謝參與了BCa細(xì)胞的順鉑耐藥。

2. 甲硫氨酸代謝通過改善細(xì)胞干性促進(jìn)BCa的順鉑耐藥

為了探究順鉑耐藥性、甲硫氨酸消耗量與癌癥干細(xì)胞特征之間的關(guān)系。研究團(tuán)隊(duì)首先驗(yàn)證了甲硫氨酸代謝相關(guān)酶的蛋白表達(dá)。在順鉑耐藥的BCa細(xì)胞中，MAT2A以及干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和Nanog高表達(dá)(圖1H)。進(jìn)一步敲低MAT2A或使用FIDAS(MAT2A的小分子抑制劑)下調(diào)T24-CR細(xì)胞中的MAT2A及其下游通路(圖1I)。貼壁細(xì)胞失去了癌癥干細(xì)胞標(biāo)記以及對甲硫氨酸消耗的高需求，而維持在類器官中的細(xì)胞保留了這些特征。腫瘤干細(xì)胞的主要表型是高潛在的致瘤能力。當(dāng)敲除MAT2A或通過FIDAS抑制MAT2A時(shí)，T24-CR細(xì)胞的球狀體形成能力(圖J)和致瘤能力(圖1K、L)下降。T24-CR-shMAT2A (IC50 = 3.29μM) 和T24-CR-FIDAS(IC50 = 7.92μM)對順鉑的敏感性也高于T24-CR細(xì)胞(圖1M)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化了BCa的順鉑耐藥增強(qiáng)了依賴于甲硫氨酸代謝的細(xì)胞干性。

3. circARHGAP10是一種在順鉑耐藥BCa細(xì)胞中通過調(diào)控MAT2A介導(dǎo)的與甲硫氨酸代謝相關(guān)的circRNA

研究團(tuán)隊(duì)對T24和T24-CR細(xì)胞以及5對良性和惡性膀胱組織進(jìn)行了高通量circRNA測序(圖2A，B)，發(fā)現(xiàn)了BCa中某些circRNA對順鉑耐藥和癌變至關(guān)重要。從這兩個(gè)數(shù)據(jù)集的交集中確定了四個(gè)下調(diào)的circRNA和三個(gè)上調(diào)的circRNA。進(jìn)一步檢測了這些T24-CR細(xì)胞中MAT2A的表達(dá)，其中某些circRNA被過度表達(dá)或下調(diào)。只有T24-CR過度表達(dá)，circOE2表達(dá)相對較低的MAT2A (圖2C)，表明circOE2可能與MAT2A介導(dǎo)的甲硫氨酸代謝相關(guān)。T24-CR-circOE2細(xì)胞也具有較低的腫瘤形成能力(圖2D，E)，表明circOE2干擾細(xì)胞干性。circOE2來源于circbank，名稱為hsa_circ_0001449 (circARHGAP10)，一種來源于4號染色體ARHGAP10基因的222nt circRNA(圖2F)。RNase R證明了線性轉(zhuǎn)錄的環(huán)狀RNA的循環(huán)降低了BCa細(xì)胞中的線性ARHGAP10水平，而沒有改變circARHGAP10水平(圖2G)，放線菌素D處理表明，circARHGAP10在BCa細(xì)胞中比線性ARHGAP10更穩(wěn)定(圖2H)。甲硫氨酸和SAM以及參與順鉑耐藥性的幾種代謝產(chǎn)物(圖1B，C)在T24-CR-circARHGAP10 OE細(xì)胞中下調(diào)(圖2I)，說明 circARGHAP10與甲硫氨酸代謝相關(guān)的circRNA。作者還觀察到MAT2A、干細(xì)胞標(biāo)記物以及組蛋白甲基化標(biāo)記物與circARHGAP10表達(dá)相關(guān)(圖2J)，這最終決定了順鉑治療期間BCa細(xì)胞的IC50(圖2K)。T24和T24-CR細(xì)胞的球形形成能力(圖2L)和致瘤能力(圖2M，N)也顯示了與circARHGAP10介導(dǎo)的MAT2A表達(dá)相關(guān)。進(jìn)一步驗(yàn)證了circARHGAP10在90對BCa TMA中的表達(dá)情況(圖2O)。

4. circARHGAP10通過泛素/蛋白酶體依賴性降解與MAT2A相互作用并破壞其穩(wěn)定

進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MAT2A與circARHGAP10之間的調(diào)節(jié)機(jī)制。采用RIP法檢測circARHGAP10在BCa細(xì)胞中是否具有miRNA海綿的功能。Ago2在抗ago2濃度顯著升高，circARHGAP10未升高(圖3A)。由于ago2介導(dǎo)的miRNA過程對miRNA代謝至關(guān)重要，在ago2和circARHGAP10之間未觀察到相互作用，這表明circARHGAP10不是ceRNA。作者進(jìn)一步使用RNA下拉法檢測了circARHGAP10的表達(dá)能力。首先，驗(yàn)證了sense探針能夠高效、特異地富集circARHGAP10(圖3B)。通過SDS-PAGE、銀染、質(zhì)譜分析分離沉淀(圖3C)。作者還發(fā)現(xiàn)MAT2A包含在豐富的相互作用蛋白中(圖3D，E)，表明MAT2A和circARHGAP10之間存在直接相互作用。進(jìn)一步鑒定了與MAT2A共定位的circARHGAP10(圖3F)以及circARHGAP10與MAT2A之間的直接相互作用(圖3G)。在circARHGAP10過表達(dá)的BCa細(xì)胞中，MAT2A的蛋白水平降低(圖3H)，并通過MG132治療消除了這種影響(圖3I)。環(huán)己亞胺追蹤實(shí)驗(yàn)分析確定，在circARHGAP10過度表達(dá)時(shí)，MAT2A的穩(wěn)定性下降(圖3J)。這些結(jié)果表明，circARHGAP10可能通過直接相互作用增強(qiáng)其泛素/蛋白酶體依賴性來破壞MAT2A的穩(wěn)定性。

5. circARHGAP10促進(jìn)E3連接酶TRIM25與MAT2A相互作用，增強(qiáng)MAT2A泛素化

將T24和T24-CR細(xì)胞的蛋白組學(xué)與circARHGAP10的RNA-pulldown進(jìn)行交叉質(zhì)譜分析，進(jìn)一步鑒定MAT2A泛素相關(guān)蛋白。兩種E3連接酶TRIM25和ISG15，以及兩種泛素特異性蛋白酶家族成員USP5和USP14在兩個(gè)治療組中顯著交替(圖4A)。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)TRIM25在T24組上調(diào)，ISG15、USP5和USP14在T24-CR組中上調(diào)(圖4B)。由于TRIM25下調(diào)或USP5和USP14上調(diào)會(huì)降低相關(guān)蛋白的泛素水平，因此選擇這三種泛素相關(guān)蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分析。然后觀察到TRIM25，在順鉑耐藥BCa細(xì)胞中與circARHGAP10相互作用(圖4C)，通過TRIM25與MAT2A的直接相互作用，進(jìn)一步確認(rèn)TRIM25是否為MAT2A的E3連接酶。共免疫沉淀分析顯示TRIM25直接與MAT2A相互作用(圖4D)，免疫熒光(IF)證實(shí)TRIM25與MAT2A共定位(圖4E)。TRIM25與MAT2A三維結(jié)構(gòu)的分子對接也表明TRIM25與MAT2A之間存在直接相互作用(圖4F)。TRIM25對MAT2A的mRNA水平?jīng)]有影響，MAT2A蛋白顯著增加(圖4G)，TRIM25過表達(dá)時(shí)，MAT2A蛋白下調(diào)(圖4H)。TRIM25ΔRBD對MAT2A蛋白水平?jīng)]有影響(圖4H)，這表明完整的RNAbinding結(jié)構(gòu)域?qū)AT2A泛素化至關(guān)重要。

?小結(jié)

綜上所述，本研究介紹了甲硫氨酸在順鉑膀胱癌微環(huán)境中的主導(dǎo)作用。通過抑制MAT2A或限制甲硫氨酸來下調(diào)甲硫氨酸通量與抑制SLC家族SLC7A6的聯(lián)合治療，可以破壞癌細(xì)胞中甲硫氨酸的高消耗并保留CD8+T細(xì)胞的功能，這對于順鉑耐藥的膀胱癌細(xì)胞患者是一個(gè)很有前景的臨床治療選擇。

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