寫在前面

????????今天推薦的是由蘇州中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院系統(tǒng)醫(yī)學(xué)中心在2019年5月31日發(fā)表于Theranostics（IF：8.393，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Yili Yang教授，研究表明泛素特異性肽酶5通過穩(wěn)定Tu翻譯延伸因子調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長。

研究背景

????????泛素特異性肽酶5（USP5）是一種普遍表達的去泛素化酶（DUB）。它已被證明參與了DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、炎癥和腫瘤細(xì)胞生長。然而，USP5在結(jié)直腸癌（CRC）中的功能和分子機制仍不清楚。在本研究中，作者研究它是如何影響結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的生長的。

摘要部分

????????作者進行了基于shRNA的高含量篩選，以確定影響CRC細(xì)胞生長的DUBs。用CCK-8試驗和異種移植來評估CRC細(xì)胞的生長、生存和腫瘤發(fā)生。進行RT-qPCR、免疫印跡和免疫組化來定量USP5在CRC組織和細(xì)胞系的表達。進行了免疫沉淀和質(zhì)譜分析，以確定USP5的相互作用蛋白。環(huán)氧乙烷追趕法用于評估Tu翻譯延伸因子（TUFM）的穩(wěn)定性。利用雙熒光素酶報告試驗對USP5啟動子進行分析。作者實驗發(fā)現(xiàn)，USP5在一組原發(fā)性CRC組織中高度表達，USP5的增加與臨床分期和總生存期的縮短相關(guān)。雖然USP5敲除有效地抑制了CRC細(xì)胞的生長，但過量表達的USP5促進了CRC細(xì)胞的生長，并使其對多柔比星（DOX）更有抵抗力。TUFM被發(fā)現(xiàn)是USP5的底物。USP5對TUFM進行了去泛素化，并提高了其在CRC細(xì)胞中的水平。強制表達TUFM能夠緩解USP5敲除誘發(fā)的生長抑制。進一步分析表明，EBF轉(zhuǎn)錄因子1（EBF1）是USP5轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)因子，DOX抑制了CRC細(xì)胞中EBF1-USP5-TUFM軸。作者得出結(jié)論，USP5是CRC細(xì)胞的必需品，并促進其生長和對化療藥物的抗性。TUFM是USP5的去泛素化底物，介導(dǎo)USP5的細(xì)胞效應(yīng)。USP5的轉(zhuǎn)錄受EBF1的調(diào)控。因此，針對EBF1-USP5-TUFM軸是一種潛在的治療CRC的新策略。

研究內(nèi)容

1.USP5調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞生長??? ??

????????為了確定參與CRC細(xì)胞生長的DUBs，利用表達各種針對DUBs的shRNA的慢病毒文庫進行了高含量篩選（HCS）。針對USP5的shRNA明顯減少了GFP的熒光，這是該篩選系統(tǒng)中細(xì)胞生長的指標(biāo)。為了驗證這一結(jié)果，用3種不同的慢病毒感染HCT116細(xì)胞，分別表達USP5靶向的shRNA#1、shRNA#2和shRNA#3。它們都明顯減少了細(xì)胞的生長，降低了USP5的水平，同時伴隨著Cyclin D1的下調(diào)。與這些結(jié)果一致，強制表達野生型USP5可以促進細(xì)胞生長，并降低多柔比星（DOX）對CRC細(xì)胞的藥物敏感性，而表達催化不活躍的USP5突變體（USP5-C335A）沒有影響。

????????作者隨后檢查了USP5敲除是否影響體內(nèi)的腫瘤生長。將表達shUSP5#3或shNC的HCT116細(xì)胞皮下接種到裸鼠體內(nèi)。USP5敲除明顯減緩了異種移植的腫瘤生長且USP5和Cyclin D1的水平都明顯低于對照組。

研究結(jié)論：USP5是CRC細(xì)胞生長的一個重要調(diào)節(jié)器。

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2.原發(fā)性結(jié)直腸癌中USP5表達增加

????????作者發(fā)現(xiàn)，在公共的GEPIA RNAseq數(shù)據(jù)庫中，USP5在結(jié)直腸腺癌中的表達明顯高于正常對照。作者通過qRT-PCR評估了二十四對CRC組織和非癌癥組織中的USP5 mRNA水平。除一對組織（#16）外，其他組織中的USP5 mRNA都明顯偏高。作者還能通過免疫印跡法檢查一些CRC細(xì)胞系中的USP5表達。與正常組織相比，USP5蛋白在CRC細(xì)胞系中高度表達。另一方面，USP5的表達水平與CRC的臨床分期相關(guān)，第四期腫瘤的USP5水平最高。此外，表達高水平USP5的CRC患者的總生存期明顯短于表達低水平USP5的患者，表明USP5的水平是CRC患者的一個信息性預(yù)后因素。

研究結(jié)論：原發(fā)性結(jié)直腸癌中USP5表達增加。

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3.USP5與TUFM相互作用

????????為了探索USP5如何影響CRC細(xì)胞的生長，作者在HEK293T細(xì)胞中表達了Myc-USP5，并用抗Myc抗體拉下USP5。對拉下來的蛋白進行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)TUFM的12個獨特肽。為了證實它們的相互作用，用表達Myc-USP5和Flag-TUFM的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進行相互共免疫沉淀試驗，實驗發(fā)現(xiàn)抗Myc或抗Flag抗體分別使TUFM或USP5下降。此外，抗USP5和抗TUFM抗體能夠分別免疫沉淀HCT116細(xì)胞中的內(nèi)源性TUFM和USP5，表明這兩種蛋白在CRC細(xì)胞中相互作用。從GEPIA數(shù)據(jù)庫中也可以發(fā)現(xiàn)，USP5和TUFM的表達在CRCs中高度相關(guān)（R=0.5），表明它們的相互作用可能在原發(fā)性CRCs中發(fā)揮重要作用。

研究結(jié)論：USP5與TUFM發(fā)生相互作用。

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4.USP5通過泛素-蛋白體途徑穩(wěn)定TUFM? ? ?

????????為了研究USP5是否可以作為DUB來影響TUFM的泛素化狀態(tài)，作者在HEK293T細(xì)胞中共同轉(zhuǎn)染了野生型USP5（USP5-WT）或突變型USP5（USP5-C335A）和TUFM的質(zhì)粒，并通過免疫印跡檢查其蛋白水平。實驗發(fā)現(xiàn)，USP5-WT的表達增加導(dǎo)致細(xì)胞中TUFM水平的劑量依賴性升高，而通過shRNAs敲除USP5導(dǎo)致TUFM的減少。另一方面，USP5的無活性突變體不能增加外源性和內(nèi)源性TUFM的表達水平。? ? ?

????????此外，在CHX追趕試驗中，隨著USP5的強制表達，TUFM的半衰期明顯延長。在暴露于蛋白酶體抑制劑MG132之后，3種不同的CRC細(xì)胞中TUFM的水平增加，而MG132在很大程度上阻止了USP5敲除后HCT116細(xì)胞中TUFM的減少。這些結(jié)果表明，TUFM的蛋白酶體降解受到細(xì)胞中USP5去泛素化作用的正向調(diào)節(jié)。

????????作者進一步檢查了TUFM的泛素化狀態(tài)。在轉(zhuǎn)染了表達Flag-TUFM和Myc-Ub的質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中，免疫沉淀的TUFM被嚴(yán)重泛素化。當(dāng)野生型USP5也被共同轉(zhuǎn)染到該系統(tǒng)中時，TUFM泛素化明顯減少。此外，敲除USP5增強了TUFM的泛素化。

研究結(jié)論：USP5直接使TUFM泛素化并增加其穩(wěn)定性。

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5.TUFM調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長并受USP5調(diào)節(jié)??? ?

????????受USP5調(diào)控 TUFM是一種線粒體蛋白，廣泛表達于不同組織，包括結(jié)腸。這與之前的研究一致，公共癌癥數(shù)據(jù)庫TCGA顯示，TUFM在CRC腫瘤中高表達。8對有代表性的腫瘤組織進行了針對TUFM和USP5的免疫印跡分析。TUFM和USP5在CRC組織中都是高表達的。

????????此外，TUFM的過表達或敲除促進或抑制了CRC細(xì)胞的生長，并調(diào)節(jié)了Cyclin D1的表達，而過表達的TUFM逆轉(zhuǎn)了shUSP5誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制和Cyclin D1下調(diào)。作者還使用了小分子USP5抑制劑WP1130。它可以劑量依賴地下調(diào)TUFM的表達。

研究結(jié)論：TUFM調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長，并受USP5的調(diào)節(jié)。

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6.EBF1調(diào)控USP5的表達

????????USP5對CRC細(xì)胞生長的影響促使作者通過使用USP5啟動子區(qū)域的不同片段驅(qū)動的熒光素酶報告來研究USP5的表達調(diào)節(jié)。含有-230/+32片段的構(gòu)建體表達了高水平的熒光素酶活性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄因子的推定結(jié)合位點，包括E2F1、E2F4、E2F6、EBF1、FOXC1、KLF5、SP1和TFAP2C。在HCT116中用siRNAs單獨沉默后，作者發(fā)現(xiàn)只有EBF1被敲除后才會明顯下調(diào)USP5。這一結(jié)果被進一步驗證，因為有更多針對EBF1的siRNA，并且發(fā)現(xiàn)過表達的EBF1促進了USP5的表達。用抗EBF1抗體進行的CHIP檢測也表明，EBF1直接與USP5啟動子結(jié)合。

研究結(jié)論：EBF1是USP5表達的一個重要調(diào)節(jié)器。

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7.阿霉素抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的EBF1-USP5-TUFM軸

????????USP5在CRC細(xì)胞生長中的重要作用促使作者研究其表達是否參與了化療藥物的抗腫瘤作用?？拱┧幬锇⒚顾兀―OX）明顯抑制了CRC細(xì)胞中USP5啟動子驅(qū)動的熒光素酶活性，并降低了USP5 mRNA水平。然后作者通過免疫印跡法檢查DOX對EBF1和TUFM表達的影響。除了USP5的表達減少外，DOX還能誘導(dǎo)HCT116和RKO細(xì)胞中EBF1和TUFM的減少。

研究結(jié)論：抗癌藥物阿霉素明顯抑制了EBF1-USP5-TUFM軸。

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結(jié)論與討論

????????在本研究中，作者表明USP5對結(jié)直腸癌細(xì)胞在培養(yǎng)和小鼠體內(nèi)的生長很重要。它使CRC細(xì)胞對化療藥物更有抵抗力，并在許多原發(fā)性CRC組織中高度表達，這與CRC患者的疾病分期和總生存率相關(guān)。TUFM被確定為USP5的底物，因此在蛋白質(zhì)水平上受到USP5的調(diào)節(jié)。此外，強制表達TUFM能夠減輕USP5敲除誘導(dǎo)的生長抑制，表明它是USP5在CRC細(xì)胞中作用的一個重要媒介。此外，作者發(fā)現(xiàn)EBF轉(zhuǎn)錄因子1 (EBF1)是USP5轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)因子。這些結(jié)果表明，EBF1-USP5-TUFM軸可能是治療CRC的新靶點。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.thno.org/v09p4208.htm