知識分享 || 遠離液相故障！如何正確選擇流動相？

2023-03-31 18:06 作者:科學(xué)指南針 0人讀過 | 我要投稿

色譜方法開發(fā)時，一般選擇常用的試劑、pH條件、緩沖鹽、以及常用色譜柱的組合作為起始條件，然后對流動相比例進行一系列調(diào)整，直至獲得比較滿意的峰形和分離效果，如何正確科學(xué)地選擇液相流動相呢。

為了節(jié)省時間、資源，流動相作為對選擇性影響最大、因而也是最重要的條件因素之一，應(yīng)首先被篩選。而通過與其他因素的相互組合下，進行優(yōu)化或微調(diào)，獲得最終想要的結(jié)果。

對最終的方法進行驗證，檢查它是否滿足預(yù)期的分離效果和分析目的。

一、液相流動相選擇原則與優(yōu)化策略

1、由強到弱
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

2、三倍規(guī)則
每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。

3、粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)

當(dāng)分離達到一定程度，應(yīng)將有機溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

二、流動相的選擇主要考慮的因素

1、流動相的性質(zhì)要求

一個理想的液相色譜流動相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。

選擇流動相時應(yīng)考慮以下幾個方面：

①流動相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時。

③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測器時，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。

④粘度要低（應(yīng)<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴散、傳質(zhì)，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。

⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。

⑥樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。

2、流動相的pH值

當(dāng)分析物含有可電離官能團時，（在不同pH條件下可處于不同程度的電離狀態(tài)，如伯、仲、叔氨基、羧酸基），pH條件將強烈影響分析物的反相保留狀態(tài)，也會造成最強烈的選擇性改變效果。

對于可電離的化合物，要獲得最強的反相保留，分析物應(yīng)盡可能的不帶電或電離，此時分析物極性相對較小，在反相色譜柱上的保留就更強，中性化合物無任何可電離基團，不受pH影響。

酸性和堿性化合物在其未電離狀態(tài)下時反向保留最大，中性化合物的保留不受pH影響。

在選擇流動相時，應(yīng)避免在化合物分子的pKa值附近篩選pH條件，否則，pH值的微小變化都會導(dǎo)致保留和選擇性的劇烈變化。

保留曲線的平臺區(qū)是分析方法耐用性較強的區(qū)域。

流動相中有鹽時，應(yīng)確保鹽不會析出。

采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調(diào)節(jié)流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。

對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠遠小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。

(三乙胺triethylamine 氨分子中的氫原子被3個乙基取代的產(chǎn)物。分子式(CH3CH2)3N。易揮發(fā)的無色液體，有氨的氣味。熔點－114.7℃，沸點89.3℃，相對密度0.7275（20／4℃）。溶于水和乙醇、乙醚等有機溶劑。三乙胺有堿性，與無機酸能生成易溶于水的鹽類?？捎蒒，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應(yīng)制取，也可用乙醇胺進行氣相烷基化反應(yīng)合成。用于制橡膠硫化促進劑、潤濕劑和殺菌劑等，也可用作溶劑和用于合成四級銨化合物。)

3、如何選擇緩沖液的PH值

在選擇緩沖液PH值之前，應(yīng)先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka兩個PH值單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰，從HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高于或低于Pka兩個單位，化合物中99％以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。

顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉(zhuǎn)變，苯甲酸的Pka等于4.2，理論上由HH公示得知，當(dāng)溶液PH值等于2.2時，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2時99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當(dāng)緩沖液PH值等于2.2時，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱，表1列出了一般緩沖液和他們的緩沖范圍。從表1知磷酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液能用于PH值等于2.2。

當(dāng)化合物只有氨基時，緩沖體系的選擇十分簡單，大多數(shù)氨基化合物在PH值小于9時都被質(zhì)子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均適合應(yīng)用，你也許會問水的PH值大約是7，為什么還用緩沖鹽，因為緩沖鹽有助于增加方法的可靠性，以及色譜峰的尖銳性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的減弱，減小化合物與硅膠表面硅羥基的作用，而使峰更尖銳，從表1 可值，任何緩沖液均可應(yīng)用于氨基化合物的分析，但我們認為PH值等于3的磷酸鉀鹽最適合用于氨基化合物的分析。

在上面兩個例子中，PH＝3的磷酸鉀鹽都能獲得良好的應(yīng)用，在一般情況下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的緩沖液，并且我們認為在氨基化合物分析中鉀鹽比鈉鹽更好。

4、有機相洗脫能力

甲醇和乙腈是反相分離的常用典型有機溶劑，除了洗脫強度、粘度（與柱背壓有關(guān)）、紫外吸收性不同，甲醇與乙腈在化學(xué)選擇性上也有所不同，甲醇可以發(fā)生氫鍵作用因此會提供顯著不同的選擇性。