免疫性血小板減少動(dòng)物模型【北京實(shí)驗(yàn)外包】

目前人類免疫性血小板減少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura,ITP)的臨床試驗(yàn)多建立在臨床藥物應(yīng)用的基礎(chǔ)上，而不是亞臨床研究。這樣的試驗(yàn)有可能因?yàn)槌霈F(xiàn)意外并發(fā)癥而被迫中止,因此建立理想的血小板減少動(dòng)物模型(animal model of thrombocyto-penia)有利于加深對(duì) ITP治療藥物機(jī)制和發(fā)病機(jī)制的理解，并進(jìn)一步探討新的診斷方法和治療方法。

（一）自發(fā)性及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

Mizutani H等發(fā)現(xiàn)一種具有遲發(fā)紅斑狼瘡傾向的(NZWXBX SB)F1 雌性小鼠。成年后逐漸出現(xiàn)血小板減少、巨核細(xì)胞增多，但形態(tài)正常，抗血小板抗體(PAIgG)升高，血小板壽命縮短，抗心磷脂酶抗體增高，這些表現(xiàn)符合ITP臨床特點(diǎn)。McKenzie 等首創(chuàng)性地將人類FcyRIIa基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入自發(fā)自身免疫的主動(dòng)型 ITP模型(W/BF1)中。雌性 NZW 鼠同 BXSB 雄性鼠相交配后，雄性F1發(fā)生了系統(tǒng)性自身免疫性疾病，系統(tǒng)性自身免疫性疾病，包括繼發(fā)于血小板自身抗體的免疫性血小板減少癥。雜交第一代小鼠的免疫性血小板減少癥能夠通過(guò)脾切除得到改善。血小板減少在雜交第一代雄性帶有 FcyRIa基因表達(dá)的小鼠中比缺少，F(xiàn)cyRⅡa基因表達(dá)的小鼠表現(xiàn)更為嚴(yán)重。McKenzie 等還將 FcRIA轉(zhuǎn)基因鼠與FcR 敲除小鼠進(jìn)行交配，檢測(cè)FcRIA在FcRI及FcRⅢ缺失的情況下發(fā)揮的免疫清除作用，結(jié)果出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫性血小板減少，證實(shí)了FcRIA在體內(nèi)免疫清除中發(fā)揮著重要作用。這些在主動(dòng)型動(dòng)物模型中的結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)cyRⅡa在體內(nèi)自身免疫性血小板減少癥中是一個(gè)重要的受體。

（二）誘發(fā)性動(dòng)物模型

【造模機(jī)制】人類巨核細(xì)胞表面有著與血小板相同的抗原決定簇，PAIgG分別作用于血小板及巨核細(xì)胞。PAIgG導(dǎo)致體內(nèi)血小板減少，血小板黏附力降低，產(chǎn)板型巨核細(xì)胞明顯減少，最終引起血小板減少。

【造模方法】選用 BALB/c小鼠，8周齡，18~22g，雌雄各半；豚鼠，3個(gè)月齡，雌雄各半。儀器藥品：恒溫培養(yǎng)箱、EDTA-Na2、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑等。模型制作

1.抗原的制備BALB/c小鼠，乙醚麻醉后，從小鼠心臟取全血，EDTA-Naz 抗凝，梯度離心分離血小板并洗滌，調(diào)整濃度為(1~2)×10°/L。

2.免疫方法 取以上血小板懸液分別與等量的完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑混勻成乳白色油包水狀做好抗原。第1周取含完全弗氏佐劑的抗原分別注射于豚鼠的后足掌、背部皮下及腹股溝；第2、3、5周取含不完全弗氏佐劑的抗原分別注射于相同部位，前后共4次注射，每次注射至少5點(diǎn)，每點(diǎn)100μ1；第6周從豚鼠心臟采不抗凝全血，1800r/min 離心10分鐘后取上清，即為豚鼠抗小鼠血小板抗血清(GP-APS)，-20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3.抗血清的處理 APS從-20℃取出，待完全融化后置于56℃水浴30分鐘，用等量BALB/C小鼠紅細(xì)胞至少吸附2次，用生理鹽水稀釋成1：4濃度,APS備用。

4.抗體效價(jià)的檢測(cè)采用簡(jiǎn)單的瓊脂擴(kuò)散法：自制10g/L瓊脂平板，用打孔器打成梅花形孔環(huán)，中間孔滴加免疫濃度血小板懸液，周圍孔滴加不同濃度的抗血清，37℃溫箱孵育24小時(shí)觀察沉淀弧，確定最佳血清稀釋度。或參照 ELISA法改進(jìn)，用國(guó)產(chǎn)干酶聯(lián)A蛋白純品代替堿性磷酸酶蛋白A酶標(biāo)抗體檢測(cè)抗血清效價(jià)。

5.模型制作將動(dòng)物隨機(jī)分為2組，免疫組注射抗血清，空白對(duì)照組注射等量生理鹽水。急性短期 ITP模型：于 BALB/c小鼠腹腔內(nèi)一次性注射抗血清 100μl。慢性持續(xù) 1Tp 模型：分別在第1、3、5、7、9、11、13天于小鼠腹腔注射抗血清,每次100μl。

6.模型檢測(cè) 急性短期 ITP模型于注射后3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24 小時(shí)采血,計(jì)數(shù)血小板、測(cè)定 PAIgG。慢性持續(xù) ITP模型可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的時(shí)間點(diǎn)采血測(cè)定以上指標(biāo)。

【模型特點(diǎn)】免疫組血小板數(shù)明顯下降,血小板黏附率明顯下降。免疫組 PAIgG 顯著升高，出血時(shí)間延長(zhǎng)與空白組比較有顯著性差異。

【注意事項(xiàng)】

1.應(yīng)選同種屬同產(chǎn)地來(lái)源動(dòng)物造模由于抗原抗體反應(yīng)的特殊性，分離抗原和造模所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)為同一種屬及同一產(chǎn)地來(lái)源。

2.應(yīng)盡可能不要造成溶血 血小板懸液中混有的其他血液成分，主要是紅細(xì)胞，應(yīng)盡可能少，否則免疫豚鼠所得的抗血清中會(huì)含有大量的抗紅細(xì)胞抗體，再注射造模動(dòng)物會(huì)引起血清病而致死亡。另外采血的過(guò)程中應(yīng)盡可能不要造成溶血。

3.免疫過(guò)程中血小板懸液與弗氏佐劑必須混合完全，乳化充分，否則免疫不易成功。免疫動(dòng)物注射部位易感染，應(yīng)注意局部消毒。注射時(shí)盡量不要注射豚鼠的前足掌；因?yàn)閲X類動(dòng)物的前肢對(duì)于其攝食非常重要。首次注射尤為重要，抗原的濃度和量一定足夠。為了盡可能多的得到抗血清，豚鼠免疫5周結(jié)束后，可以2次采血，間隔以1～2日為佳，過(guò)長(zhǎng)效價(jià)會(huì)降低，過(guò)短血容量不易恢復(fù)。

4.對(duì)抗血清的處理主要包括兩方面 補(bǔ)體滅活和抗原的吸附。用做抗原吸附的純系動(dòng)物紅細(xì)胞制備起來(lái)就比較困難，如果不能把血小板從用作吸附的紅細(xì)胞懸液中分離出去，吸附過(guò)程中抗血清的滴度會(huì)大大降低。實(shí)踐證明：如果前面提取血小板的方法成熟，抗原純度較好，紅細(xì)胞吸附的過(guò)程完全可以省略。

5.抗體效價(jià)的檢測(cè)多采用ELISA法根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，采用經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單的瓊脂擴(kuò)散法，基本可以達(dá)到檢測(cè)出抗血清效價(jià)的目的。其操作過(guò)程類似于肥達(dá)氏反應(yīng)，采用抗血清與生理鹽水倍比稀釋的方法，獲得不同的血清滴度。梅花形孔環(huán)是專門用于對(duì)比血清稀釋度的，中間孔滴加免疫濃度血小板懸液同時(shí)應(yīng)滴加1/4體積的SDS，周圍孔滴加倍比稀釋的不同濃度的抗血清，37℃溫箱孵育24小時(shí)，觀察沉淀弧，以確定血清的效價(jià)。

6.應(yīng)根據(jù)研究需要建立急性或慢性模型急性ITP模型基本一次注射抗血清即可建立，但慢性ITP模型的建立首次注射的量應(yīng)稍大，并且連續(xù)注射若干次后，由于小鼠機(jī)體內(nèi)

【應(yīng)用范圍】該模型為了解免疫性血小板減少疾病的發(fā)病機(jī)制和探索新的治療手段提供了一條好的途徑?？捎糜诿庖咝匝“鍦p少性紫癜的治療藥物篩選。

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