電荷異構(gòu)體介紹及表征

目前，抗體類藥物大多是通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)。在產(chǎn)品的生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)冗^程中，往往會(huì)發(fā)生產(chǎn)品的聚集、降解以及各種翻譯后修飾，從而導(dǎo)致產(chǎn)品的分子大小、電荷、糖型等不均一性及其相應(yīng)的異構(gòu)體產(chǎn)生。人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）在Q6B指導(dǎo)原則中根據(jù)這些異構(gòu)體對(duì)產(chǎn)品安全性、有效性的影響程度，將其分為產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)以及產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。因此對(duì)產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)以及產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的鑒別、質(zhì)量研究和質(zhì)量控制具有重要意義。

一、電荷異構(gòu)體的概念

研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)修飾均能通過改變電荷基團(tuán)的數(shù)量或結(jié)構(gòu)，使抗體表面電荷發(fā)生變化，造成電荷異質(zhì)性。這些存在電荷異質(zhì)性的蛋白被稱為電荷異構(gòu)體（Charge Variant）。

二、電荷異構(gòu)體的形成原因以及影響

1、主峰的常見成分

主峰并不是無修飾或者無降解的完整的抗體分子，事實(shí)上主峰是由幾種主要修飾組成，常見成分如表1所示：

表1.主峰（Main peak）的常見成分

2、酸性異構(gòu)體（Acidic peak）的常見成分

酸性異構(gòu)體形成的原因主要是分子上酸性基團(tuán)的引入、堿性基團(tuán)的丟失以及分子構(gòu)象的改變。常見成分如表2所示：

表2.酸性異構(gòu)體（Acidic Peak）的常見成分

3、堿性異構(gòu)體（Basic Peak）的常見成分

堿性異構(gòu)體的形成原因主要是分子上堿性基團(tuán)的引入、堿性基團(tuán)的不完全切除以及構(gòu)象的改變。常見成分如表3所示：

表3.堿性峰（Basic Peak）的常見成分

4、其他修飾

還有很多修飾、聚集或者降解引起的電荷改變不固定，視具體情況而定，如表4所示：

表4.其他修飾

三、電荷異構(gòu)體檢測(cè)方法

電荷異構(gòu)體檢測(cè)是根據(jù)抗體所帶電荷的差異進(jìn)行分離檢測(cè)，常用的檢測(cè)方法有離子交換色譜（IEX）、毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）、毛細(xì)管等電聚焦電泳（cIEF），以及成像毛細(xì)管等電聚焦電泳（iCIEF）等。在圖譜中，與主要物質(zhì)（Main peak）相比，pI較低的電荷物質(zhì)稱為酸性異構(gòu)體（Acidic peak），pI點(diǎn)較高的電荷物質(zhì)稱為堿性異構(gòu)體（Basic peak）。不同的分析方法，酸堿峰的出峰順序也不同，若采用CEX分離，酸性異構(gòu)體則在主要物質(zhì)之前被洗脫，堿性異構(gòu)體則在主要物質(zhì)之后被洗脫，而CZE則相反。

四、電荷異構(gòu)體表征方法

如前面所述，色譜法和電泳法常常用來分離電荷異構(gòu)體，那么如何對(duì)電荷異構(gòu)體進(jìn)行詳細(xì)的表征同樣是一個(gè)難題。

1、在線直接分析

1.1 IEX-MS直接分析

離子交換色譜(IEX) 作為一種經(jīng)典的電荷異構(gòu)體表征的分析技術(shù)，基于與色譜固定相接觸的抗體異構(gòu)體的表面電荷差異，采用鹽濃度梯度、pH梯度或兼顧兩者來實(shí)現(xiàn)分離。該方法往往需要高濃度鹽，與質(zhì)譜(MS)不兼容，故無法直接表征電荷異構(gòu)體。但是使用可揮發(fā)性鹽（如銨鹽類），就可以在液相上實(shí)現(xiàn)分離的同時(shí)兼容質(zhì)譜檢測(cè)鑒定。

1.2 CE-MS直接分析

近年來毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜技術(shù)已實(shí)現(xiàn)抗體經(jīng)CE分離后直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。如下圖所示：

以上兩種方法均可實(shí)現(xiàn)電荷異構(gòu)體的直接分離后實(shí)時(shí)分子量檢測(cè)鑒定，表征不同的電荷異構(gòu)體的分子量差異，如相差128Da通常是賴氨酸變異。CE-MS可實(shí)現(xiàn)肽段鑒定，能夠定量更小的修飾。但這兩種方法也有其局限性：一是IEX-MS直接分析和CE-MS直接分析只能從完整分子量或者亞基分子量角度分析異構(gòu)體的不同，定性誤差較大；二是兩種方法樣品量少且不易于在線分離富集用于其他檢測(cè)；三是高糖基化樣品會(huì)影響分離度和質(zhì)譜響應(yīng)值，并且糖型修飾復(fù)雜，會(huì)增加定性分析難度。

2、分離收集后表征

由于直接分析方法的局限性，更多情況下會(huì)采用分離收集后再表征的方式。

2.1 離子交換（IEX）分離收集

通過IEX方法進(jìn)行抗體電荷異構(gòu)體分離，根據(jù)出峰時(shí)間進(jìn)行收集，進(jìn)行濃縮后用于進(jìn)一步的表征。如圖5所示：

IEX方法分離規(guī)?？梢院苋菀椎陌幢壤糯?，以收集足夠的樣品用于質(zhì)譜分析和活性分析。但是該方法分離度低，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)每個(gè)異構(gòu)體峰精準(zhǔn)分離收集，同時(shí)富集過程耗時(shí)耗力。

2.2 置換色譜（Displacement Chromatography）分離收集

置換色譜是一種非線性色譜技術(shù)，是指樣品進(jìn)去色譜柱后，用另外一只一種與固定相作用力極強(qiáng)的置換劑通入色譜柱，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。樣品在置換劑的推動(dòng)下前進(jìn)，使樣品中各組分按作用力強(qiáng)弱的次序，形成一系列前后相鄰的譜帶，流出色譜柱，使得電荷異構(gòu)體得以分離。如圖6所示：

相對(duì)于IEX分離收集而言，置換色譜上樣量大、產(chǎn)率高、分辨率高、并且分離過程中組分會(huì)自行濃縮，省時(shí)省力。但是該方法使用的置換劑（如已商業(yè)化的陽離子層析置換劑Sachem Expell SP1）成本較高，選擇較難，并且伴隨堿性異構(gòu)體的洗脫過程中會(huì)有少量置換劑被洗脫，不利于細(xì)胞活性分析以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

2.3 自由流電泳（FFE）分離收集

在FFE中，蛋白樣品被連續(xù)引入分離室，并通過流體動(dòng)力流沿著分離室的長(zhǎng)度推動(dòng)，當(dāng)樣品通過分離室時(shí)，垂直于流體流動(dòng)方向施加電場(chǎng)。分離緩沖液中存在的兩性離子產(chǎn)生pH梯度，導(dǎo)致基于電荷異構(gòu)體的pI值的等電聚焦。將聚焦的異構(gòu)體推出分離室，并收集成單獨(dú)的餾分，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同電荷異構(gòu)體的表征。如圖7所示：

圖7.FFE分離收集原理、電泳圖以及表征結(jié)果圖

3、?酶解法

雖然餾分收集幾乎是徹底表征抗體電荷異構(gòu)體的第一步，但在餾分收集前可以通過消化酶確定某些修飾對(duì)電荷異構(gòu)體的貢獻(xiàn)是多少（如通過唾液酸酶可確定唾液酸對(duì)酸性異構(gòu)體的貢獻(xiàn)，CPB酶可確定賴氨酸對(duì)堿性異構(gòu)體的貢獻(xiàn)），如圖8所示：

圖8.抗體經(jīng)CPB酶切前后IEX圖譜

五、電荷異構(gòu)體對(duì)抗體功能的影響

電荷異構(gòu)體的產(chǎn)生會(huì)影響抗體藥物的藥物代謝動(dòng)力。

電荷異構(gòu)體對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)的影響

目前普遍認(rèn)為抗體電荷變異對(duì)其藥效學(xué)影響并不顯著?；蛱┛斯驹鴮?duì)上市抗體及臨床前抗體藥物關(guān)于電荷變化產(chǎn)生的藥效、藥代等方面的影響做過一個(gè)總結(jié)，結(jié)果表明：

①當(dāng)電荷變異超過一個(gè)pH單位時(shí)，會(huì)影響藥物的組織分布及藥代動(dòng)力學(xué)；

②增加正電荷，會(huì)提高藥物的組織停滯，降低血液清除；

③降低正電荷，會(huì)減少藥物的組織停滯，提高藥物的全身清除。

圖9.電荷異構(gòu)體的血清濃度（A：靜脈注射 ?B：皮下注射）

六、總結(jié)

在單抗產(chǎn)生過程中，消除酸堿異構(gòu)體是不可能的，也是沒有必要的。有一些可能是重組單抗所特有的修飾，有一些是與特定的宿主表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)的。并且對(duì)生物功能的影響取決于修飾的部位和水平。對(duì)于Fc非關(guān)鍵位點(diǎn)的修飾，即使存在更高水平的修飾也可能不會(huì)對(duì)結(jié)合親和力產(chǎn)生顯著影響。同樣，位于Fab區(qū)的修飾可能不會(huì)影響Fc相關(guān)功能。但是，評(píng)估酸性或堿性異構(gòu)體與主要物質(zhì)在穩(wěn)定性和功能性方面的差異是有必要的，并且抗體異質(zhì)性的程度也反映了抗體生產(chǎn)工藝的一致性，因此對(duì)電荷異構(gòu)體的表征和質(zhì)控至關(guān)重要。

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