一，磁化細(xì)胞分離器(MACS)分離法分離NK細(xì)胞簡(jiǎn)介

從外周血分離單個(gè)核細(xì)胞，以粘附法除去其中的單核細(xì)胞后，以尼龍棉柱法除去其中的B細(xì)胞，余下的T細(xì)胞和NK細(xì)胞以磁化細(xì)胞分離器(MACS)進(jìn)行分離。

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二、MACS分離法分離NK細(xì)胞所需材料

牛血清白蛋白，PBS，尼龍棉柱，鏈霉親和素，臺(tái)盼藍(lán)，RPMI-1640，磁化細(xì)胞分離器等

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三、MACS分離法分離NK細(xì)胞操作方法

1. 分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）：見(jiàn)聚蔗糖-泛影葡胺分離法。

2. 將單個(gè)核細(xì)胞的濃度用含10%血清RPMI-1640調(diào)整為4×106 /ml，加入到無(wú)菌的塑料平皿中，37℃，7.5%CO2 環(huán)境中培養(yǎng)2h后，除去粘附于塑料的單核細(xì)胞和B細(xì)胞；

3. 非粘附細(xì)胞與含10%血清RPMI-1640液預(yù)孵育1h后過(guò)尼龍棉柱，B細(xì)胞和剩余的單核細(xì)胞粘附在尼龍棉柱上，用培養(yǎng)液洗柱，收集洗下的T細(xì)胞和NK細(xì)胞；

4. 用磁場(chǎng)分離T細(xì)胞和NK細(xì)胞：以無(wú)菌操作標(biāo)記和分離細(xì)胞。新分離的T細(xì)胞和NK細(xì)胞在水浴中進(jìn)行標(biāo)記，細(xì)胞先與抗表面抗原的單抗孵育10min（107 個(gè)細(xì)胞用100ul抗CD3單抗或25ul抗CD16單抗或抗CD56單抗），細(xì)胞經(jīng)洗滌后與生物素標(biāo)記的100ul羊抗鼠抗血清孵育10min，洗滌后加入FITC標(biāo)記的鏈霉親和素25ul，反應(yīng)8min，洗滌后加生物素標(biāo)記的磁顆粒（加抗CD3單抗者加100ul磁顆粒，加25ul抗CD16單抗或抗CD56單抗者加50ul磁顆粒）反應(yīng)8min。

上述每步反應(yīng)后，均以10倍體積的含1%牛血清白蛋白的PBS洗滌，3000r/min離心8min，以終止反應(yīng)。使用磁化細(xì)胞分離器(MACS)作免疫磁性分離。分離柱在使用前以高壓滅菌。

5. 將標(biāo)記有磁性復(fù)合物的細(xì)胞懸液重懸于2～5ml含1%牛血清白蛋白的PBS中，調(diào)其細(xì)胞濃度為5×107 ～1×108 細(xì)胞/ml。將分離柱先與含1%牛血清白蛋白的PBS預(yù)孵育30min，4℃預(yù)冷后放入永久性磁鐵的磁場(chǎng)中，將標(biāo)記細(xì)胞懸液加80～100ml。將分離柱拿出磁場(chǎng)，用50ml洗液在無(wú)菌條件下以注射器輕輕加壓洗脫標(biāo)記的細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞，用熒光顯微鏡分析，用臺(tái)盼藍(lán)估計(jì)存活率，以RPMI-1640液保存。